CHI VIỆT NAM
Kết quả định lƣợng polysaccharid trong 12 mẫu nấm Linh chi nhƣ sau:
Bảng 3.13: Kết quả định lượng polysaccharid trong nấm Linh chi
Tên mẫu Khối lƣợng cân (g) Khối lƣợng polysaccharid thô Độ hấp thụ Tổng lƣợng PS so với dƣợc liệu khô (%)
Mẫu nấm Linh chi trồng
GLT – 1 5,0015 94,6 0,6383 0,710 5,0025 94,9 0,6401 0,728 5,0048 95,0 0,6339 0,712 Trung bình 0,717 RSD (%) 1,35 GLT – 2 5,0018 93,8 0,6303 0,685 5,0023 93,9 0,6289 0,684 5,0036 94,0 0,6178 0,670 Trung bình 0,680 RSD (%) 1,21 GLT – 3 5,0012 99,1 0,7753 0,768
5,0060 99,2 0,7849 0,771 5,0028 99,1 0,7728 0,756 Trung bình 0,765 RSD (%) 0,99 GLT – 4 5,0024 100,2 0,7661 0,855 5,0062 100,3 0,7713 0,861 5,0048 100,3 0,7818 0,874 Trung bình 0,863 RSD (%) 1,09 GLT – 5 5,0017 99,4 0,7123 0,790 5,0058 99,5 0,7237 0,803 5,0029 99,4 0,7258 0,806 Trung bình 0,799 RSD (%) 1,06 GLT – 6 5,0022 80,7 0,3265 0,269 5,0036 80,8 0,3325 0,276 5,0017 80,6 0,3318 0,275 Trung bình 0,273 RSD (%) 1,51 GLT – 7 5,0020 81,3 0,3231 0,275 5,0021 81,3 0,3259 0,275 5,0092 81,9 0,3301 0,279 Trung bình 0,276 RSD (%) 0,74 GLT – 8 5,0091 100,1 0,7354 0,824 5,0099 100,1 0,7312 0,798 5,0083 100,1 0,7279 0,815 Trung bình 0,812 RSD (%) 1,62 GLT – 9 5,0029 99,9 0,7176 0,823 5,0037 99,9 0,7309 0,840 5,0018 99,9 0,7354 0,837 Trung bình 0,833 RSD (%) 1,04
Mẫu nấm Linh chi tự nhiên
GLN – 1 5,0039 100,0 0,6867 0,817 5,0040 100,0 0,6908 0,822 5,0049 100,0 0,7089 0,836 Trung bình 0,825 RSD (%) 1,24 GLN – 2 5,0013 99,7 0,6912 0,759 5,0020 99,9 0,7045 0,775 5,0022 99,9 0,7079 0,779
Trung bình 0,771 RSD (%) 1,35 GLN – 3 5,0050 93,8 0,5622 0,611 5,0055 93,8 0,5678 0,611 5,0061 93,9 0,5712 0,609 5,0038 93,7 0,5528 0,599 5,0043 93,8 0,5498 0,595 5,0031 93,7 0,5514 0,597 Trung bình 0,604 RSD (%) 1,22
Tổng lƣợng polysaccharid trong các mẫu nấm Linh chi nghiên cứu từ 0,2 – 0,8% so với dƣợc liệu khô. Theo dƣợc điển Trung Quốc, hàm lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi không đƣợc thấp hơn 0,5% so với dƣợc liệu khô. Trong các mẫu khảo sát có hai mẫu nấm GLT – 6 và GLT – 7 có hàm lƣợng polysaccharid thấp hơn 0,5%, còn lại các mẫu nấm khác đều chứa polysaccharid với hàm lƣợng từ 0,5% trở lên (so với dƣợc liệu khô). Do đó có thể xây dựng chỉ tiêu định lƣợng tổng lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi theo phƣơng pháp tạo màu với thuốc thử phenol – acid sulfuric, yêu cầu tổng lƣợng polysaccharid quy về glucose (tính theo dƣợc liệu khô) không đƣợc thấp hơn 0,5%.
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 VỀ ĐẶC ĐIỂM THỂ QUẢ, BỘT NẤM LINH CHI
Nghiên cứu bổ sung thêm một số đặc điểm thể quả nấm Linh chi so với dƣợc điển Việt Nam IV về màu sắc của thể quả, thể quả có thể bóng hoặc không bóng, có cuống hoặc không có cuống.
Bột nấm Linh chi có hai đặc điểm đặc trƣng nhất là sợi nấm và bào tử. Đặc điểm bào tử của nấm Linh chi có thể dùng để phân biệt với các loài khác trong chi
Ganoderma.
4.2 VỀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH NẤM LINH CHI BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO HPTLC MỎNG HIỆU NĂNG CAO HPTLC
Dung môi khai triển là dichloromethan – methanol (9:1) là hệ dung môi 2 cấu tử đơn giản hơn hệ dung môi 3 cấu tử: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (15:5:1) (Dƣợc điển Việt Nam IV bản bổ sung); ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ethyl format – acid formic (15:5:1) (Dƣợc điển Trung Quốc); toluen – ethyl format – acid formic (5:5:0,2) (Dƣợc điển Mỹ) cho hiệu quả tách tốt các thành phần của nấm Linh chi. Hệ dung môi dichloromethan – methanol (9:1) cũng gồm các thành phần dung môi phổ biến, dễ tìm và ít gây độc hại đến kiểm nghiệm viên.
Các mẫu nấm Linh chi Việt Nam có các vết ở vị trí và có màu sắc tƣơng đối giống nhau khi quan sát ở bƣớc sóng 254 nm, 366 nm và sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ EtOH. Các thành phần giữa mẫu nấm Linh chi Việt Nam và Hàn Quốc cũng có một vài sự khác biệt.
Chất đối chiếu là acid ganoderic A sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ EtOH có màu xanh da trời, và Rf = 0,32 đối với hệ dung môi dichloromethan – methanol (9:1). Chất này có trong mẫu nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu) và các mẫu nấm GLT – 1, GLT – 2, GLT – 3, GLT – 4, GLT – 5, GLN – 1, tƣơng đồng với kết quả định tính bằng phƣơng pháp HPLC. Mẫu nấm GLN – 3 có hàm lƣợng acid ganoderic A thấp thì phƣơng pháp này không phát hiện đƣợc acid ganoderic A có trong mẫu nấm.
4.3 VỀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG ACID GANODERIC A BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC A BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC
Phƣơng pháp chiết có dƣới sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm có tần số và cƣờng độ cao để truyền qua chất lỏng hay chất khí giúp phá vỡ thành tế bào sinh học, tạo thuận lợi cho việc giải phóng dịch cần chiết. Do đó, phƣơng pháp cho hiệu quả cao và tiết kiệm thời gian hơn so với phƣơng pháp ngâm thông thƣờng.
Phƣơng pháp định lƣợng acid ganoderic A trong nấm Linh chi bằng HPLC – DAD với cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) và pha động gồm hỗn hợp acid acetic 1% và acetonitril có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác cao. Loại cột đƣợc sử dụng là cột có kích cỡ hạt 5 µm là loại cột đƣợc sử dụng phổ biến trong điều kiện phòng thí nghiệm hơn loại cột có kích cỡ hạt 4 µm, cho thời gian phân tích hợp lý (40 phút), rút ngắn so với rửa giải gradient trong các công trình đã công bố và các pic tách nhau rõ ràng.
Nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp siêu âm mà không dùng phƣơng pháp ngâm nhƣ trong tài liệu tham khảo số 16. Phƣơng pháp siêu âm cho hàm lƣợng acid ganoderic A cao hơn rõ rệt so với phƣơng pháp ngâm.
4.3 HÀM LƢỢNG ACID GANODERIC A TRONG CÁC MẪU NẤM LINH CHI NGHIÊN CỨU CHI NGHIÊN CỨU
Hàm lƣợng acid ganoderic A không đồng đều trong các mẫu nấm thu hái tại các tỉnh khác nhau hoặc trong cùng một tỉnh. Các mẫu nấm Linh chi nghiên cứu có hàm lƣợng acid ganoderic A từ 0,08 – 0,3 % so với dƣợc liệu khô. Một số mẫu Nấm Linh chi trồng và mẫu Nấm Linh chi tự nhiên không phát hiện chứa acid ganoderic A. Năm mẫu nấm Linh chi GLT – 1, GLT – 2, GLT – 3, GLT – 4 và GLT – 5 đều thu hái tại Quảng Nam nhƣng có hàm lƣợng acid ganoderic A khác nhau, lần lƣợt là 0,16 %, 0,15 %, 0,29 %, 0,32 % và 0,30 %. Nhƣ vậy, chất lƣợng nấm Linh chi không chỉ phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng.
Các mẫu Nấm Linh chi trồng cho hàm lƣợng acid ganoderic A cao hơn mẫu nấm tự nhiên. Mẫu nấm GLT – 4 cho hàm lƣợng acid ganoderic A là cao nhất. Nhƣ vậy cần khảo sát thêm hàm lƣợng và sự có mặt của các triterpenoid khác trong nấm
Linh chi để xây dựng đƣợc chỉ tiêu định lƣợng thành phần triterpenoid trong nấm Linh chi.
4.4 VỀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG POLYSACCHARID BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO QUANG PHƢƠNG PHÁP ĐO QUANG
Nghiên cứu sử dụng dung môi là nƣớc để chiết polysaccharid trong nấm Linh chi. Một số tài liệu tham khảo sử dụng dung môi kiềm, tuy nhiên một số tài liệu tham khảo cũng đã chứng minh khi chiết bằng dung dịch kiềm thì lƣợng polysaccharid thô thu đƣợc có lẫn nhiều tạp hơn. Mặt khác, do tính chất của polysaccharid tan tốt trong nƣớc, do đó lựa chọn dung môi chiết là nƣớc, vừa an toản, rẻ tiền và hiệu quả.
Polysaccharid cho một màu vàng cam khi đƣợc phản ứng với phenol và acid sulfuric đậm đặc. Phản ứng này rất nhạy và màu sắc ổn định trong nhiều giờ, đƣợc xác định ở bƣớc sóng 490 nm. Phản ứng này đƣợc sử dụng để xác định tổng lƣợng polysaccharid thu đƣợc từ Ganoderma lucidum P.Karst tính theo D-glucose. Phƣơng pháp có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác cao có thể sử dụng bổ sung cho phƣơng pháp sử dụng thuốc thử anthron nêu trong dƣợc điển Trung Quốc.
Tuy nhiên phƣơng pháp tạo màu với thuốc thử phenol – acid sulfuric cũng có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng tạo màu nhƣ: thứ tự cho phenol, acid sulfuric và mẫu thử; thể tích phenol 5% và acid sulfuric đậm đặc cũng nhƣ thời gian ủ hỗn hợp phản ứng. Theo nhiều tài liệu tham khảo thì thứ tự mẫu thử - phenol – acid sulfuric cho độ hấp thụ tối đa, đƣợc giải thích là do sự có mặt sẵn phenol trong dung dịch thì khi đƣờng furfural đƣợc tạo thành thì phản ứng tạo màu giữa phenol và đƣờng furfural sẽ xảy ra nhanh chóng trƣớc bất cứ sự cạnh tranh nào hoặc trƣớc khi đƣờng furfural phân hủy. Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến phản ứng tạo màu này. Khi chỉ lắc hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng thì cho độ hấp thụ không ổn định. Tuy nhiên, khi sau khi lắc, đun hỗn hợp phản ứng trong bể cách thủy ở 70°C trong 10 phút thì độ hấp thụ thu đƣợc ổn định hơn và đạt tối đa.
Phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV – VIS làphƣơng pháp phân tích hiện đại đƣợc áp dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm. Phƣơng pháp cho kết quả phân tích nhanh với độ chính xác cao.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã nghiên cứu đƣợc đặc điểm quả thế, đặc điểm bột nấm Linh chi, giới hạn độ ẩm của nấm Linh chi
2. Đã nghiên cứu xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính nấm Linh chi bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC.
3. Đã nghiên cứu xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính, định lƣợng acid ganoderic A trong nấm Linh chi bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC:
- Khảo sát và lựa chọn đƣợc phƣơng pháp chiết acid ganoderic A - Khảo sát và lựa chọn đƣợc các thông số tối ƣu cho quá trình sắc ký:
Cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) Bƣớc sóng phát hiện: 254 nm
Nhiệt độ cột: 30°C
Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút Thể tích tiêm: 20 µl
Thời gian phân tích: 40 phút
Pha động: acetonitril – acid acetic 1% (30:70) Chế độ chạy đẳng dòng
- Phƣơng pháp đã đƣợc thầm định trên điều kiện thiết bị hiện có cho kết quả đáng tin cậy với những thông số sau:
Khoảng tuyến tính: 120 µg/ml đến 400 µg/ml Giới hạn phát hiện: 2,5 µg/ml
Giới hạn định lƣợng: 8,13 µg/ml Độ chính xác (RSD %): < 2% Độ đúng (%): 98% - 102%
4. Đã định lƣợng đƣợc hàm lƣợng acid ganoderic A trong 12 mẫu nấm Linh chi Việt Nam, kết quả cho thấy có 5/12 mẫu không có acid ganoderic A và có 7/12 mẫu có acid ganoderic A với hàm lƣợng từ 0,02 – 0,32%
5. Đã nghiên cứu xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV – VIS và định lƣợng đƣợc hàm lƣợng polysaccharid trong 12 mẫu nấm Linh chi Việt Nam.
KIẾN NGHỊ
Khảo sát thêm hàm lƣợng của các thành phần triterpenoid khác trong nấm Linh chi Việt Nam để có cơ sở xây dựng hàm lƣợng triterpenoid phù hợp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan, Phạm Thị Vân Anh (2005), "Nghiên cứu tác dụng của nấm Linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số lipid máu ở chuột cống", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 38(5).
2. Bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam IV (2015)
3. Bộ Y tế (2013), Dược liệu học, Tập 1, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr. 135 - 139.
4. Bộ Y tế (2013), Hóa phân tích, Tập 2, Nhà xuất bản Y học Hà Nội,
5. Mai Thành Chung, Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2012), "Khảo sát hoạt tính khử gốc tự do superoxid và tác dụng trên glutathion peroxidase trong gan của nấm Linh chi đỏ và nấm Linh chi Vàng", Tạp chí Dược liệu, 17(5), tr. 275 – 281.
6. Nguyễn Thƣợng Dong, Bùi Thị Bằng, Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Trần Mỹ Tiên, Lƣơng Kim Bích, Nguyễn Kim Phƣợng, Đỗ Thị Phƣơng, Nguyễn Thị Phƣơng, Đinh Thị Mai Hƣơng (2006),”Nghiên cứu tác dụng trên trí nhớ của 3 loài nấm linh chi trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopotamin”, Tạp chí Dược liệu, 11(1), tr. 35-40.
7. Nguyễn Thƣợng Dong, Bùi Thị Bằng, Nguyễn Kim Phƣợng, Đỗ Thị Phƣơng, Nguyễn Thị Phƣơng, Đinh Thị Mai Hƣơng (2005), "Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của 3 loài nấm Linh chi trên mô hình gây viêm gan cấp bằng tetraclorur carbon (CCL4)", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr. 192 - 196.
8. Trần Đình Duy, Hà Đức Cƣờng, Nguyễn Đăng Thoại, Trần Mạnh Hùng (2013), "Nghiên cứu tác dụng dự phòng và điều trị suy giảm bạch cầu của cao Linh chi (Ganoderma lucidum) và chế phẩm Linh chi trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng pactitaxel và carboplatin", Tạp chí Dược học, 53(450), tr.15 - 19.
9. Nguyễn Anh Dũng (1995), "Góp phần vào nghiên cứu các thành tố hóa học của
Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst.", Tạp chí Dược học, 229, tr. 14 – 16.
10. Dƣợc điển Việt Nam IV
11. Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Trịnh Văn Tấn (2011), "Nghiên cứu tác dụng tăng cƣờng miễn dịch của nấm Linh chi đỏ trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid", Tạp chí Dược liệu, 16(1+2), tr. 69 - 74.
12. Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam, Tập 1 (Tái bản lần thứ 2), NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 41, 135 - 157.
13. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
14. Nguyễn Phƣơng Đại Nguyên (2013), Nấm Linh chi ở Tây Nguyên, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
15. Trần Thị Văn Thi, Nguyễn Thị Hoài, Lê Trung Hiếu (2012), “Chiết xuất, xác định hàm lƣợng và khảo sát tác dụng dƣợc lý của phân đoạn polysaccharid từ nấm linh chi nuôi trồng tại Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Dƣợc học, 52 (433), 18-22.
16. Trần Thị Văn Thi, Nguyễn Thị Hoài, Nguyễn Thị Phƣợng, Lê Trung Hiếu, Lê Lâm Sơn (2012), "Khảo sát một số tác dụng dƣợc lý của phân đoạn triterpenoid từ nấm Linh chi trồng tại Thừa Thiên Huế", Tạp chí Dược liệu, 17(3), tr. 154 - 158.
17. Phạm Bảo Trƣơng và Nguyễn Minh Thủy (2015), “Tối ƣu hóa quá trình trích ly polysaccharide và tannin trong nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum)”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 36 (2015): 21-28.
18. Nguyễn Ngọc Vinh, Lê Thị Thu Cúc, Phan Nhƣ Trúc, Trần Việt Hùng (2016) "Xây dựng quy trình định tính, định lƣợng acid ganoderic A bằng phƣơng pháp HPLC trong nấm Linh chi - Ganoderma lucidum (Leyss ex. Fr.) Karst".
Tạp chí Dược học, 56, 48-51.
19. Kiểm nghiệm 116 dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (2016), Nhà xuất bản y học, 224-226.
Tài liệu tiếng Anh
20. American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium
21. Bao X., Liu C., Fang J., Li X. (2001), "Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst.”,
Carbohydrat Research, 332, 67-74.
22. Bao X., Fang J., Li X. (2001), “Structural characterization and immunomodulating activity of a complex glucan from spores of Ganoderma lucidum”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (11), pp. 2384-2391.
23. Boh B., Berovic M., Zhang J., Zhi-Bin L. (2007), “Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds”, Biotechnology Annual Review, 13, pp. 265-301.
24. Chen N. H., Liu J.W., Zhong J.J. (2010), “Ganoderic acid T inhibits tumor invasion in vitro and in vivo through inhibition of MMP expression”, Pharmacological Reports, 62(1), pp.150-63.
25. Cheng C. R., Yue Q. X., Wu Z. Y., Song X. Y., Tao S. J., Wu X. H., Xu P. P., Liu X., Guan S. H., Guo D. A. (2010), “Cytotoxic triterpenoids from
Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 71, pp. 1579–1585.
26. Cheng P., Chia-Wei Phan, Vikineswary Sabaratnam, Noorlidah Abdullah, Mahmood Ameen Abdulla, Umah Rani Kuppusamy (2013), “Polysaccharides rich extract of Ganoderma lucidum (M.A. Curtis:Fr.) P. Karst accelerates wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013, pp.9.
27. Chen Y., Yan Y., Xie M.Y., Nie S.P., Liu W., Gong X.F., Wang Y.X. (2008), “Development of a chromatographic fingerprint for the chloroform extracts of
Ganoderma lucidum by HPLC and LC-MS.”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 47(3), pp. 469-77.
28. Da J. (2015), “A reproducible analytical system based on the multi-component analysis of triterpene acids in Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 114, pp. 146-54.
29. el-Mekkawy S. , Meselhy R. Meselhy, Norio Nakamura, Yasuhiro Tezuka, Masao Hattori, Nobuko Kakiuchi, Kunitada Shimotohno, Takuya Kawahata, Toru otake (1998), “Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease substances from
Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 49(6), pp.1651-7.
30. Falandysz J. (2008) "Selenium in edible mushrooms.". J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev., 26 (3), 256-299.
31. Gao Y., Tang W., Gao H., Chan E., Lan J., Zhou S. (2004), "Ganoderma lucidum polysaccharide fractions accelerate healing of acetic acid-induced