2.4.1 Định danh thực vật
Các mẫu Nấm Linh chi sau khi thu hái đƣợc gửi chuyên gia về nấm để định danh thực vật.
Nấm đƣợc sấy khô bằng tủ sấy ở 100°C, bảo quản trong túi nilon kín, tránh ánh sáng và ở điều kiện phòng thí nghiệm.
2.4.2 Mô tả dƣợc liệu
Quan sát mẫu ở ánh sáng thƣờng. Mô tả hình dạng, kích thƣớc, màu sắc và thể chất của dƣợc liệu.
2.4.3 Mô tả đặc điểm bột dƣợc liệu
Sấy khô dƣợc liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 100°C sau đó dùng máy xay và thuyền tán nghiền nhỏ. Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm nƣớc, đặt lam kính lên, đi nhẹ lam kính và quan sát dƣới kính hiển vi vật kính x40 để xác định đặc điểm bột.
2.4.4 Xác định độ ẩm
* Nguyên tắc: Việc xác định độ ẩm đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp khối lƣợng. Cân khối lƣợng nguyên liệu trƣớc và sau khi sấy, khối lƣợng mất sau khi sấy đi đƣợc xem là khối lƣợng nƣớc tự do có trong mẫu, từ đó tính độ ẩm của mẫu.
* Tiến hành: Sấy bì đựng mẫu thử trong tủ sấy ở áp suất thƣờng trong thời gian 30 phút. Cân xác định khối lƣợng bì là m0 (g).
Cân khoảng 1 g bột dƣợc liệu, dàn mỏng, sấy ở nhiệt độ 100°C đến khối lƣợng không đổi. Sau khi sấy làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân ngay. Xác định khối lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy là m’ (g). Xác định thời gian làm khô và giới hạn độ ẩm của nấm Linh chi. Xác định độ ẩm tƣơng đối của nguyên liệu theo công thức sau:
Độ ẩm (%) = m – m’ 100% m – m0
Trong đó:
m0: khối lƣợng cốc cân đã sấy khô đến khối lƣợng không đổi m: khối lƣợng cốc và bột nấm Linh chi trƣớc khi sấy
m’: khối lƣợng cốc và bột nấm Linh chi sau khi sấy đến khối lƣợng không đổi
2.4.5 Định tính nấm Linh chi bằng phƣơng pháp TLC
Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký lớp mỏng nhƣ sau: 1. Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel GF254
2. Pha động: Khảo sát 3 hệ dung môi khai triển nhƣ sau: + Hệ A: Dichloromethan – methanol (9:1)
+ Hệ B: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (15:5:1)
+ Hệ C: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1)
3. Chuẩn bị mẫu:
- Dung dịch thử: Cân khoảng 2 g bột thô dƣợc liệu, thêm 30 ml methanol, đun hồi lƣu 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 2 ml methanol.
- Dung dịch đối chiếu:
+ Dung dịch 1: Cân khoảng 2 g bột thô Linh chi (mẫu nấm đối chiếu) tiến hành chiết nhƣ mẫu thử
4. Thuốc thử: chọn thuốc thử H2SO4 10 %/EtOH
5. Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 10 cm đến 12 cm, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí, quan sát bản mỏng ở bƣớc sóng 254 nm, 366 nm và sau khi phun thuốc thử hiện màu.
- Yêu cầu: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf, với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
2.4.6 Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng acid ganoderic A trong nấm Linh chi bằng HPLC
2.4.6.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu
Khảo sát các quy trình xử lý mẫu sau: * Quy trình 1:
- Dung môi chiết: NaHCO3 5%
- Phƣơng pháp chiết: siêu âm, ngâm chiết - Thời gian chiết: 3h, 3h30, 4h
- Tiến hành: Cân chính xác khoảng 2g bột nấm linh chi cho vào bình nón nút mài dung tích 250 ml, thêm 40 ml dung dich NaHCO3 5% siêu âm, sau đó chiết lấy dịch kiềm. Tiếp tục thêm 40 ml dung dịch NaHCO3 5% vào cắn siêu âm và chiết dịch kiềm. Tiếp tục siêu âm cắn với 20 ml dung dịch NaHCO3 5%. Tâp trung dịch chiết kiềm, acid hóa bằng dung dịch acid hydrochloric 1N đến pH < 3. Dịch sau khi acid hóa đƣợc chiết bằng chloroform 3 lần (40 x 30 x 30 ml). Tập trung dịch chloroform và bay hơi đến cắn. Hòa cắn trong 20 ml methanol. Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 µm.
* Quy trình 2:
- Dung môi chiết: chloroform - Phƣơng pháp chiết: siêu âm - Thời gian chiết: 3h, 3h30, 4h
- Tiến hành: Cân chính xác khoảng 2g bột nấm linh chi cho vào bình nón nút mài dung tích 250 ml, thêm 40 ml dung dich chloroform siêu âm, sau đó chiết lấy dịch. Tiếp tục thêm 40 ml dung dịch chloroform vào cắn siêu âm và chiết dịch kiềm. Tiếp
tục siêu âm cắn với 20 ml dung dịch chloroform. Tâp trung dịch chiết chloroform, chiết bằng NaHCO3 5% 3 lần (40 x 30 x 30). Tập trung dịch chiết kiềm, acid hóa bằng dung dịch acid hydrochloric 1N đến pH < 3. Dịch sau khi acid hóa đƣợc chiết bằng chloroform 3 lần (40 x 30 x 30 ml). Tập trung dịch chloroform và bay hơi đến cắn. Hòa cắn trong 20 ml methanol. Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 µm.
2.4.6.2 Khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC
Xác định các điều kiện cho phân tích HPLC nhƣ: cột sắc ký, pha động, bƣớc sóng phát hiện, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu….
2.4.6.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi lựa chọn đƣợc điều kiện sắc ký, thẩm định quy trình định lƣợng với các nội dung sau:
* Độ đặc hiệu: Tiến hành:
Tiêm lần lƣợt dung dịch mẫu trắng, chuẩn và thử vào hệ thống, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.
Ghi lại các sắc ký đồ và thời gian lƣu (RT) của acid ganoderic A trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn, dung dịch mẫu thử và trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng (nếu có).
Yêu cầu:
Sắc ký đồ các dung dịch thử cho pic có thời gian lƣu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ dung dịch thử nếu xuất hiện thêm các pic khác (pic tạp) không phải pic của hoạt chất cần phân tích, thì pic của hoạt chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic tạp và đáp ứng các yêu cầu chung của phƣơng pháp sắc ký lỏng đƣợc quy định trong dƣợc điển.
Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng pic phải ≤ 1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn.
Phổ hấp thụ tử ngoại của pic tƣơng ứng với acid ganoderic A trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải tƣơng ứng nhau
* Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành:
Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch acid ganoderic A chuẩn có nồng độ thích hợp, và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.
Ghi SKĐ và xác định thời gian lƣu, diện tích pic, hệ số bất đối của pic acid ganoderic A và số đĩa lý thuyết của cột tính theo pic acid ganoderic A. Tính RSD (%) của diện tích pic và thời gian lƣu.
Yêu cầu: Giá trị RSDthời gian lƣu ≤ 1,0%, RSDdiện tích pic ≤ 2,0%
* Độ tuyến tính: Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn, có nồng độ 50%; 80%; 100%, 120% và 150% so với nồng độ định lƣợng ở phần độ lặp lại.
Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, ghi lại các sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic. Xác định phƣơng trình hồi quy, hệ số tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu đƣợc trên các sắc ký đồ bằng phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu.
Yêu cầu: Hệ số tƣơng quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,998.
* Độ lặp lại:
Tiến hành:
Tiến hành định lƣợng 06 mẫu thử độc lập.
Xác định hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu thử
Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu.
Yêu cầu:Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu ≤ 2,0%.
* Độ chính xác trung gian
Tiến hành:
Tiến hành nhƣ độ lặp lại nhƣng khác ngày
Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu trong mỗi ngày
Yêu cầu:
Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng của mỗi ngày (n=6) ≤ 2,0% và của cả hai ngày (n=12) phải ≤ 3,0%.
* Độ đúng
Tiến hành:
Xác định độ đúng của phƣơng pháp bằng cách thêm chính xác một lƣợng chất chuẩn cần phân tích vào các mẫu thử.
Chuẩn bị 03 loại mẫu bằng cách thêm chính xác một lƣợng chất chuẩn chất cần phân tích vào các mẫu thử. Lƣợng chất chuẩn thêm vào tƣơng ứng với 3 mức nồng độ 110%, 120% và 130% so với mức hàm lƣợng định lƣợng tại độ lặp lại. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập.
Phân tích mẫu theo qui trình phân tích. Xác định hoạt chất thu hồi theo dung dịch chuẩn C100 hoặc phƣơng trình hồi quy tuyến tính ở phần độ tuyến tính.
Xác định độ đúng của phƣơng pháp theo công thức:
Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) = Lƣợng hoạt chất tìm lại x 100 % Lƣợng hoạt chất thêm vào
Yêu cầu:
Tỷ lệ thu hồi trong khoảng 98 – 102% ở mỗi mức nồng độ.
RSD tỷ lệ thu hồi (≤ 2,0%) ở mỗi mức nồng độ. * Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Pha loãng dần mẫu chuẩn bằng dung môi pha mẫu. Tiến hành phân tích các dung dịch pha loãng trên. Trên sắc ký đồ thu đƣợc, xác định đáp ứng pic (chiều cao) tƣơng ứng với mỗi mức nồng độ. Xác định giá trị LOD của phƣơng pháp dựa và tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu. Trong đó LOD là giá trị nồng độ ở đó có đáp ứng pic acid ganoderic A gấp khoảng 3 lần nhiễu đƣờng nền.
Sau khi xác định giá trị LOD, tính giá trị LOQ thông qua công thức: LOQ= 10/3 LOD (kl/tt)
2.4.7 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lƣợng hàm lƣợng acid ganoderic A trong các mẫu nấm Linh chi
Ứng dụng quy trình định lƣợng đã xây dựng để đánh giá hàm lƣợng acid ganoderic A trong 12 mẫu Nấm Linh chi nghiên cứu.
Hàm lƣợng acid ganoderic A trong Nấm Linh chi đƣợc tính theo đƣờng chuẩn và theo công thức:
X =
Cc
( ) p 100
Trong đó:
X: Hàm lƣợng của acid ganoderic A có trong dƣợc liệu (%) Sc: Diện tích đỉnh của mẫu chuẩn
St: Diện tích đỉnh của mẫu thử Cc: Nồng độ của mẫu chuẩn (mg/ml) k: Độ pha loãng của mẫu đo
m: Khối lƣợng cân dƣợc liệu (mg) h: Độ ẩm của dƣợc liệu
p: Độ tinh khiết của chất chuẩn (%)
2.4.8 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng polysaccharid (PS) trong nấm Linh chi bằng phƣơng pháp đo quang chi bằng phƣơng pháp đo quang
* Nguyên tắc chiết PS:
- Chiết PS trong Ganoderma lucidum bằng nƣớc nóng - Kết tủa PS bằng EtOH 96°
Bột dƣợc liệu
V ml H2O, T°C, t giờ Bã dƣợc liệu
Dịch nƣớc
EtOH 96°, T’°C, để qua đêm PS thô
2.4.8.1 Lựa chọn nhiệt độ chiết tối ưu
Theo tài liệu tham khảo [15], [65], lựa chọn nhiệt độ đun hồi lƣu là 100°C.
2.4.8.2 Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành chiết đến khi thu đƣợc dịch chiết không màu. Cô cách thủy dịch chiết đến còn 50 ml, thêm 200 ml ethanol 96% vào và khuấy đều. Để lạnh ở 2°C trong 24 giờ. Dịch chiết đƣợc coi là không chứa PS nếu không thu đƣợc kết tủa.
2.4.8.3 Khảo sát thời gian và điều kiện phản ứng
Hòa tan 10 mg PS thô trong 100 ml nƣớc cất (dung dịch B). Hút 2 ml dung dịch B, thêm 2 ml phenol 5% và 10 ml acid sulfuric đậm đặc. Làm nguội hỗn hợp phản ứng. Khảo sát điều kiện phản ứng:
- Lắc đều
- Đun cách thủy nhiệt độ 30°, 40°, 50°, 60°, 70°, 80°, 90°C trong thời gian 10 – 15 – 20 phút. Lựa chọn điều kiện phản ứng cho độ hấp thụ cao nhất.
2.4.8.4 Khảo sát thể tích ethanol 96% thêm vào để kết tủa polysaccharid
Lần lƣợt cho thêm 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml ethanol 96% vào 50 ml dịch chiết. Để lạnh ở 2°C trong 24 giờ. Ly tâm 3500 vòng/phút, trong 10 phút. Xác định tủa PS thô. Xác định PS tinh khiết theo phƣơng pháp sau:
* Chuẩn bị mẫu định lƣợng :
- Mẫu trắng : Hút 2 ml phenol 5% trong ethanol, cho vào bình nón nút mài 50 ml, thêm 10 ml dung dịch acid sulfuric đậm đặc vào, lắc đều, đun cách thủy.
- Mẫu chuẩn : Cân chính xác và hòa tan khoảng 25 mg D-glucose trong vừa đủ 250 ml nƣớc cất (dung dịch A có nồng độ 0,1 mg/ml). Pha loãng dung dịch A thành các dung dịch A1, A2, A3, A4, A5 có nồng độ lần lƣợt : 0,01 mg/ml (A1); 0,02 mg/ml (A2); 0,03 mg/ml (A3); 0,04 mg/ml (A4); 0,06 mg/ml (A5). Hút 2,0 ml mỗi dung dịch A, A1, A2, A3, A4, A5 cho vào 6 bình nón nút mài 50 ml, thêm 2 ml phenol 5% và 10 ml acid sulfuric đậm đặc, lắc đều, đun cách thủy.
- Mẫu thử : Hòa tan 10 mg PS thô trong 100 ml nƣớc cất (dung dịch B). Hút 2,0 ml dung dịch B vào bình nón nút mài 50 ml, thêm 2 ml phenol 5% và 10 ml acid sulfuric đậm đặc, làm nguội, lắc đều, đun cách thủy.
Quét phổ từ 200 nm đến 800 nm tìm bƣớc sóng hấp thụ cực đại. Hàm lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi đƣợc tính dựa vào phƣơng trình hồi quy của dãy tuyến tính.
2.4.8.5 Thẩm định phương pháp
* Độ đặc hiệu
Tiến hành: Đo phổ hấp thụ UV – VIS của các mẫu sau:
Mẫu trắng: phenol 5%/ EtOH + H2SO4 đậm đặc
Mẫu chuẩn: chứa đƣờng D-glucose chuẩn
Mẫu thử
Yêu cầu: phổ của dung dịch thử phải trùng với phổ dung dịch chuẩn hoặc các cực đại hấp thụ thu đƣợc từ dung dịch thử phải tƣơng đƣơng với các cực đại hấp thụ thu đƣợc từ dung dịch chuẩn.
* Độ tuyến tính Tiến hành:
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần từ một dung dịch chuẩn gốc
Đo độ hấp thụ theo quy trình đã nêu
Yêu cầu: Hệ số tƣơng quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,995. * Độ đúng
Tiến hành
Thêm một lƣợng D-glucose chuẩn (đã biết hàm lƣợng) vào mẫu thử bằng cách cân một lƣợng D-glucose chuẩn vào mẫu thử (110 %, 120 %, 130 % nồng độ mẫu thử). Tại mỗi mức nồng độ thực hiện 3 mẫu thử.
Đo độ hấp thụ của các dung dịch trên. Mỗi dung dịch đo 3 lần. Tính kết quả dựa vào đƣờng chuẩn
Xác định độ đúng theo công thức:
Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) = Lƣợng hoạt chất tìm lại x 100 % Lƣợng hoạt chất thêm vào
Yêu cầu:
Tỷ lệ thu hồi trong khoảng 98 – 102% ở mỗi mức nồng độ.
RSD tỷ lệ thu hồi (≤ 2,0%) ở mỗi mức nồng độ.
* Độ lặp lại:
Tiến hành:
Tiến hành định lƣợng 06 mẫu thử độc lập.
Xác định hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu thử
Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu.
Yêu cầu:Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu ≤ 2,0%.
* Độ chính xác trung gian
Tiến hành:
Tiến hành nhƣ độ lặp lại nhƣng khác ngày
Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu trong mỗi ngày
Xác định mức độ sai khác kết quả định lƣợng giữa 2 ngày. Yêu cầu:
Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng của mỗi ngày (n=6) ≤ 2,0% và của cả hai ngày (n=12) phải ≤ 3,0%.
2.4.9 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lƣợng hàm lƣợng polysaccharid trong các mẫu nấm Linh chi trong các mẫu nấm Linh chi
Ứng dụng quy trình định lƣợng đã xây dựng để đánh giá hàm lƣợng polysaccharid trong 12 mẫu Nấm Linh chi nghiên cứu. Hàm lƣợng polysaccharid trong các mẫu nấm đƣợc tính theo đƣờng chuẩn.
2.4.10 Xử lý số liệu
- Các kết quả thu đƣợc trong quá trình nghiên cứu đƣợc xử lý bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC, quang phổ UV – VIS.
- Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toàn