Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất này ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên [4], [10].
Kết quả của quá trình tách các chất đƣợc detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt đƣợc tách ra trên sắc đồ. Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố lỏng – lỏng, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký pha liên kết, sắc ký gel. Trong đó sắc ký phân bố đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay[4], [10].
Máy HPLC gồm các bộ phận sau: hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể đƣợc sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị). Pha động đƣợc cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thƣờng với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector [4], [10].
Sau đây là một số thông số đặc trƣng của kỹ thuật HPLC:
Thời gian lưu tR (phút)
Thời gian lƣu t R là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lƣu là đại lƣợng để phát hiện định tính các chất.
Hệ số dung lượng k ’
Hệ số dung lƣợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2 pha và đƣợc tính theo sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lƣợng chất tan trong pha tĩnh và lƣợng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
Độ chọn lọc α
Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A, B có kA’ và kB’ khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc α (α từ 1,5 đến 2,0 là tối ƣu). Nếu α quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài.
Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa (H)
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký nhƣ là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động học, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học đƣợc thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.
Độ phân giải R
Độ phân giải biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Trong thực tế nếu các pic cân đối (Gauss) thì để 2 pic có độ lớn bằng nhau đƣợc coi là tách ra khỏi nhau hoàn toàn thì độ phân giải tối thiểu phải là 1,5.
Hệ số bất đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ thu đƣợc. T đƣợc tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao pic. Trong phép định lƣợng yêu cầu 0,8 ≤ T ≤ 2,0.