chi bằng phƣơng pháp đo quang
* Nguyên tắc chiết PS:
- Chiết PS trong Ganoderma lucidum bằng nƣớc nóng - Kết tủa PS bằng EtOH 96°
Bột dƣợc liệu
V ml H2O, T°C, t giờ Bã dƣợc liệu
Dịch nƣớc
EtOH 96°, T’°C, để qua đêm PS thô
2.4.8.1 Lựa chọn nhiệt độ chiết tối ưu
Theo tài liệu tham khảo [15], [65], lựa chọn nhiệt độ đun hồi lƣu là 100°C.
2.4.8.2 Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành chiết đến khi thu đƣợc dịch chiết không màu. Cô cách thủy dịch chiết đến còn 50 ml, thêm 200 ml ethanol 96% vào và khuấy đều. Để lạnh ở 2°C trong 24 giờ. Dịch chiết đƣợc coi là không chứa PS nếu không thu đƣợc kết tủa.
2.4.8.3 Khảo sát thời gian và điều kiện phản ứng
Hòa tan 10 mg PS thô trong 100 ml nƣớc cất (dung dịch B). Hút 2 ml dung dịch B, thêm 2 ml phenol 5% và 10 ml acid sulfuric đậm đặc. Làm nguội hỗn hợp phản ứng. Khảo sát điều kiện phản ứng:
- Lắc đều
- Đun cách thủy nhiệt độ 30°, 40°, 50°, 60°, 70°, 80°, 90°C trong thời gian 10 – 15 – 20 phút. Lựa chọn điều kiện phản ứng cho độ hấp thụ cao nhất.
2.4.8.4 Khảo sát thể tích ethanol 96% thêm vào để kết tủa polysaccharid
Lần lƣợt cho thêm 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml ethanol 96% vào 50 ml dịch chiết. Để lạnh ở 2°C trong 24 giờ. Ly tâm 3500 vòng/phút, trong 10 phút. Xác định tủa PS thô. Xác định PS tinh khiết theo phƣơng pháp sau:
* Chuẩn bị mẫu định lƣợng :
- Mẫu trắng : Hút 2 ml phenol 5% trong ethanol, cho vào bình nón nút mài 50 ml, thêm 10 ml dung dịch acid sulfuric đậm đặc vào, lắc đều, đun cách thủy.
- Mẫu chuẩn : Cân chính xác và hòa tan khoảng 25 mg D-glucose trong vừa đủ 250 ml nƣớc cất (dung dịch A có nồng độ 0,1 mg/ml). Pha loãng dung dịch A thành các dung dịch A1, A2, A3, A4, A5 có nồng độ lần lƣợt : 0,01 mg/ml (A1); 0,02 mg/ml (A2); 0,03 mg/ml (A3); 0,04 mg/ml (A4); 0,06 mg/ml (A5). Hút 2,0 ml mỗi dung dịch A, A1, A2, A3, A4, A5 cho vào 6 bình nón nút mài 50 ml, thêm 2 ml phenol 5% và 10 ml acid sulfuric đậm đặc, lắc đều, đun cách thủy.
- Mẫu thử : Hòa tan 10 mg PS thô trong 100 ml nƣớc cất (dung dịch B). Hút 2,0 ml dung dịch B vào bình nón nút mài 50 ml, thêm 2 ml phenol 5% và 10 ml acid sulfuric đậm đặc, làm nguội, lắc đều, đun cách thủy.
Quét phổ từ 200 nm đến 800 nm tìm bƣớc sóng hấp thụ cực đại. Hàm lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi đƣợc tính dựa vào phƣơng trình hồi quy của dãy tuyến tính.
2.4.8.5 Thẩm định phương pháp
* Độ đặc hiệu
Tiến hành: Đo phổ hấp thụ UV – VIS của các mẫu sau:
Mẫu trắng: phenol 5%/ EtOH + H2SO4 đậm đặc
Mẫu chuẩn: chứa đƣờng D-glucose chuẩn
Mẫu thử
Yêu cầu: phổ của dung dịch thử phải trùng với phổ dung dịch chuẩn hoặc các cực đại hấp thụ thu đƣợc từ dung dịch thử phải tƣơng đƣơng với các cực đại hấp thụ thu đƣợc từ dung dịch chuẩn.
* Độ tuyến tính Tiến hành:
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần từ một dung dịch chuẩn gốc
Đo độ hấp thụ theo quy trình đã nêu
Yêu cầu: Hệ số tƣơng quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,995. * Độ đúng
Tiến hành
Thêm một lƣợng D-glucose chuẩn (đã biết hàm lƣợng) vào mẫu thử bằng cách cân một lƣợng D-glucose chuẩn vào mẫu thử (110 %, 120 %, 130 % nồng độ mẫu thử). Tại mỗi mức nồng độ thực hiện 3 mẫu thử.
Đo độ hấp thụ của các dung dịch trên. Mỗi dung dịch đo 3 lần. Tính kết quả dựa vào đƣờng chuẩn
Xác định độ đúng theo công thức:
Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) = Lƣợng hoạt chất tìm lại x 100 % Lƣợng hoạt chất thêm vào
Yêu cầu:
Tỷ lệ thu hồi trong khoảng 98 – 102% ở mỗi mức nồng độ.
RSD tỷ lệ thu hồi (≤ 2,0%) ở mỗi mức nồng độ.
* Độ lặp lại:
Tiến hành:
Tiến hành định lƣợng 06 mẫu thử độc lập.
Xác định hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu thử
Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu.
Yêu cầu:Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu ≤ 2,0%.
* Độ chính xác trung gian
Tiến hành:
Tiến hành nhƣ độ lặp lại nhƣng khác ngày
Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu trong mỗi ngày
Xác định mức độ sai khác kết quả định lƣợng giữa 2 ngày. Yêu cầu:
Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng của mỗi ngày (n=6) ≤ 2,0% và của cả hai ngày (n=12) phải ≤ 3,0%.
2.4.9 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lƣợng hàm lƣợng polysaccharid trong các mẫu nấm Linh chi trong các mẫu nấm Linh chi
Ứng dụng quy trình định lƣợng đã xây dựng để đánh giá hàm lƣợng polysaccharid trong 12 mẫu Nấm Linh chi nghiên cứu. Hàm lƣợng polysaccharid trong các mẫu nấm đƣợc tính theo đƣờng chuẩn.
2.4.10 Xử lý số liệu
- Các kết quả thu đƣợc trong quá trình nghiên cứu đƣợc xử lý bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC, quang phổ UV – VIS.
- Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toàn học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính toán: phƣơng trình hồi qui tuyến tính bậc nhất, kết quả trung bình, độ lệch, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tƣơng đối, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phƣơng pháp.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊNH DANH THỰC VẬT
Toàn bộ mẫu nấm Linh chi nghiên cứu đƣợc định danh bởi bởi TS. Nguyễn Phƣơng Đại Nguyên – trƣờng Đại học Tây Nguyên. Các mẫu nấm Linh chi đều đƣợc xác định là loài Ganoderma lucidum.
3.2 MÔ TẢ HÌNH THỂ
Hình thể các mẫu nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) đƣợc mô tả trong bảng sau: Bảng 3. 1: Mô tả hình thể Tên mẫu Quả thể Hình ảnh GLT – 1
Mũ nấm hình hạt đậu. Mặt trên màu nâu đỏ, bóng loáng nhƣ đánh vecni, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 12 – 15 cm, đƣờng kính 1,5 – 2,5 cm, màu nâu đỏ bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 2
Mũ nấm hình hạt đậu. Mặt trên màu nâu đỏ sẫm đến nâu đen, bóng loáng nhƣ đánh vecni, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu nâu nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 12 – 15 cm, đƣờng kính 1,5 – 2,5 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 3
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ bóng, nhạt dần từ cuống nấm đến rìa, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 7 – 10 cm, đƣờng kính 1,5 – 2,5 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 4
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đen, bóng, nhạt dần từ cuống nấm đến rìa, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 8 – 9 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 5
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ, màu không đều nhau, có những vết trắng, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra; mép nhẵn, hơi lƣợn sóng và có màu vàng nâu. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 11 – 13 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm, màu nâu đen. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 6
Mũ nấm hình thận, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu nhạt, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều. Mặt dƣới màu vàng nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống. Mùi
thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 7
Mũ nấm hình thận, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu nhạt, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều. Mặt dƣới màu vàng nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 8
Mũ nấm hình quạt, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu đỏ, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống.
GLT – 9
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu, nhiều bột, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng, màu vàng nâu. Mặt dƣới màu vàng với các lỗ nhỏ li ti. Cuống ngắn. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLN – 1
Mũ nấm hình thận đến hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 8 – 9 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLN – 2
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 4 – 5 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLN – 3
Mũ nấm hình quạt, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu đỏ, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều, hơi lƣợn sóng và màu vàng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
Từ những đặc điểm hình thái của 12 mẫu nấm Linh chi trên cùng mô tả trong bản bổ sung dƣợc điển Việt Nam, có thể đƣa ra đặc điểm hình thể nấm Linh chi nhƣ sau: Thể quả dạng hình thận, hình hạt đậu hay hình quạt, hóa gỗ, cứng. Mặt trên màu nâu nhạt, nâu vàng, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng hoặc không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nhạt đến nâu nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống hoặc cuống hình trụ, đính lệch, dài 4 cm đến 15 cm, đƣờng kính 1 cm đến 3,5 cm, màu nâu đỏ đến nâu đen. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
3.3 MÔ TẢ BỘT DƢỢC LIỆU
Các bột nấm Linh chi đều có những đặc điểm chung nhƣ sau: Bột màu nâu vàng. Soi dƣới kính hiển vi thấy: Sợi nấm rải rác hoặc tụ thành đám, không màu hoặc nâu nhạt, mảnh, hơi cong, phân nhánh hoặc không phân nhánh, đƣờng kính 2,5 µm đến 6 µm. Bào tử hình trứng, màu nâu, đứng riêng lẻ hay tụ thành đám, dài 8 µm đến 12 µm, rộng 5 µm đến 8 µm, đỉnh trơn nhẵn, lớp vỏ ngoài không màu, lớp vỏ trong có nhiều chỗ lồi ra.
Hình 3.2: Bột nấm Linh chi GLT – 2
Hình 3.3 Bột nấm Linh chi GLT – 3
Hình 3.5: Bột nấm Linh chi GLT – 5
Hình 3.6: Bột nấm Linh chi GLT – 6
Hình 3.8: Bột nấm Linh chi GLT – 8
Hình 3.9: Bột nấm Linh chi GLT – 9
Hình 3.11: Bột nấm Linh chi GLN – 2
Hình 3.12: Bột nấm Linh chi GLN – 3
3.4 XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM
Bảng 3.2: Độ ẩm của 12 mẫu nấm Linh chi Tên mẫu Khối lƣợng cốc (g) Khối lƣợng cốc và bột nấm trƣớc khi sấy (g) Khối lƣợng cốc và bột nấm sau khi sấy (g) Độ ẩm (%) GLT – 1 48,9091 49,9122 49,7502 16,15 48,2574 49,2607 49,0987 16,14 48,8815 49,8855 49,7233 16,16 Trung bình 16,15 GLT – 2 49,8153 50,8186 50,6566 15,20 48,2650 49,2965 49,1168 15,20 48,3782 49,3808 49,22669 15,35 Trung bình 15,25 GLT – 3 48,8211 49,8297 49,6983 13,04 49,1028 50,1082 49,9769 13,06 47,4791 48,4829 48,3519 13,05 Trung bình 13,05 GLT – 4 48,9091 49,9113 49,7968 11,43 48,2650 49,2678 49,1529 11,46 48,8815 49,8846 49,7696 11,46 Trung bình 11,45 GLT – 5 49,8153 50,8188 50,6863 13,20 48,3782 49,3821 49,2486 13,30 49,1028 50,1078 49,9741 13,30 Trung bình 13,20 GLT – 6 48,2650 49,2704 49,1409 12,88 47,4791 48,4839 48,3545 12,93 48,8815 49,8845 49,7552 12,89 Trung bình 12,90 GLT – 7 48,9091 49,9111 49,7874 12,35 49,1028 50,1057 49,9813 12,40 48,3782 49,3807 49,2569 12,30 Trung bình 12,35 GLT – 8 49,8153 50,8178 50,6863 13,12 48,2574 49,2606 49,1294 13,08 48,8815 49,8853 49,7538 13,10 Trung bình 13,10 GLT – 9 48,2650 49,2695 49,1171 15,17 47,4791 48,4839 48,3307 15,25 48,9091 49,9141 49,7615 15,18 Trung bình 15,20 GLN – 1 49,1028 50,1066 49,9475 15,85
48,8815 49,8896 49,7293 15,90 48,8211 49,8261 49,6658 15,95 Trung bình 15,90 GLN – 2 48,2574 49,2586 49,1625 9,6 47,4791 47,4809 47,3817 9,9 48,2650 49,2671 49,1679 9,9 Trung bình 9,8 GLN – 3 49,1028 50,1056 49,9612 14,40 48,9091 49,9126 49,7674 14,47 48,8815 49,8855 49,7401 14,48 Trung bình 14,45
Nhƣ vây, tất cả các mẫu nấm Linh chi đều có độ ẩm không vƣợt quá 17,0%, đạt chỉ tiêu độ ẩm theo nhƣ Dƣợc điển Trung Quốc và Dƣợc điển Việt Nam IV bản bổ sung. Do đó, chỉ tiêu về độ ẩm của nấm Linh chi có thể để giới hạn là 17,0%.
3.5 ĐỊNH TÍNH NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC
Hệ dung môi: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (15:5:1) cho Rf các vết quá thấp, do đó tỷ lệ đƣợc điều chỉnh thành ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1).
Trong 3 hệ dung môi lựa chọn khảo sát, hệ dung môi: Dichloromethan – methanol (9:1) tách đƣợc nhiều vết và rõ ràng nhất. Chất đối chiếu acid ganoderic A sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 %/ EtOH có màu xanh da trời. Đối chiếu màu sắc và Rf = 0,32 của chất chuẩn acid ganoderic A với các mẫu thử, phát hiện acid ganoderic A trong các mẫu nấm Linh chi GLT - 1, GLT - 2, GLT - 3, GLT - 4, GLT - 5, GLN - 1.
Các sắc ký đồ với hệ dung môi dichloromethan – methanol (9:1) (hình 3.13, hình 3.14, hình 3.15):
Hình 3.13:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol
ở bƣớc sóng 254 nm
Hình 3.14:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol
Hình 3.15:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 %/ EtOH
Chú thích:
(1): GLT – 1; (2): GLT – 2; (3): GLT – 3; (4): GLT – 4; (5): GLT – 5; (6) GLT – 6; (7): GLT – 7; (8): GLT – 8; (9): GLT – 9; (10): GLN – 1; (11): GLN – 2; (12):
GLN – 3; (13) Nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu); (14): chất đối chiếu acid ganoderic A
Các sắc ký đồ với hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) (hình 3.16, hình 3.17, hình 3.18).
Hình 3.16: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 254 nm
Hình 3.17:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 366 nm
Hình 3.18:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) sau khi phun thuốc thử
H2SO4 10%/ EtOH Chú thích:
(1): GLT – 1; (2): GLT – 2; (3): GLT – 3; (4): GLT – 4; (5): GLT – 5; (6) GLT – 6; (7): GLT – 7; (8): GLT – 8; (9): GLT – 9; (10): GLN – 1; (11): GLN – 2; (12):
GLN – 3; (13) Nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu); (14): chất đối chiếu acid ganoderic A
Qua những khảo sát trên, lựa chọn quy trình định tính nấm Linh chi bằng sắc ký lớp mỏng nhƣ sau:
1. Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel GF254
2. Pha động: Dichloromethan – methanol (9:1) 3. Chuẩn bị mẫu:
- Dung dịch thử: Cân khoảng 2 g bột thô dƣợc liệu, thêm 30 ml methanol, đun hồi lƣu 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 2 ml methanol.
- Dung dịch đối chiếu: Cân khoảng 2 g bột thô Linh chi (mẫu chuẩn) tiến hành chiết nhƣ mẫu thử (hoặc dung dịch acid ganoderic A chuẩn 0,1 mg/ml)
4. Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 10 cm đến 12 cm, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí, quan sát bản mỏng ở bƣớc sóng 254 nm và sau