Dung môi để chiết xuất các hợp chất triterpenpid trong chi Ganoderma là diclomethan [25], methanol [29], [28], [57], ethanol [68], chloroform [68], [23] hoặc dung dịch kiềm [18].
1.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Dƣợc điển Mỹ sử dụng acid ganoderic A làm một trong các chất đối chiếu trong định tính nấm Linh chi bằng HPTLC, với hệ dung môi toluen – ethyl format – acid formic (5 : 5 : 0,2) [66].
Các tác giả PGS. TS. Nguyễn Ngọc Vinh, Ths. Nguyễn Thị Kim Danh [19] cũng chọn GAA để làm chất đối chiếu, và sử dụng hệ dung môi: chloroform – methanol – nƣớc (30 : 4 : 1), lấy lớp dƣới.
1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Dƣợc điển Mỹ [67] định lƣợng thành phần GAA trong nấm Linh chi bằng phƣơng pháp HPLC, sử dụng cột L1 (2,1 mm x 15 cm, 1,8 µm); detector UV 257 nm; nhiệt độ cột 25 ± 1°; tốc độ dòng 0,4 ml/phút với pha động nhƣ sau:
- Dung dịch A: acid phosphoric/nƣớc 0,075% - Dung dịch B: acetonitril
Chƣơng trình gradient:
Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%)
0 80 20 3 73,5 26,5 34 73,5 26,5 52 61,5 38,5 54 0 100 55 0 100 55,5 80 20
Theo Jie Liu và cộng sự [52] sử dụng HPLC rửa giải gradient, pha động acid acetic 2%/nƣớc (v/v, dung dịch A) và acetonitril (dung dịch B) đã định lƣợng đƣợc 5 triterpenoid, trong đó có acid ganoderic A.
Theo Jing Zhao và cộng sự [72] đã định lƣợng đồng thời 8 triterpen (gồm GAA và acid ganoderic Y, acid ganoderic DM, ganoderol A, ganoderol B, ganoderal A, methyl ganoderat D, ganoderate G) và sterol bằng HPLC rửa giải gradient, sử dụng cột Zorbax ODS C18, thành phần pha động gồm nƣớc (dung dịch A) và methanol (dung dịch B).
Phƣơng pháp HPLC rửa giải đẳng dòng cũng đƣợc sử dụng để phân tích GAA. Với các điều kiện sắc ký: Alltima C18 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), pha động
acetonitril- acid formic 0,04%, bƣớc sóng phát hiện 254 nm, nhiệt độ cột 15°C, Li B. M. [48] đã định lƣợng đồng thời GAA cùng acid ganoderic C2, acid ganoderic G, acid ganoderenic B, acid ganoderic B, acid ganoderenic A, acid ganoderic A, acid lucideric A, acid ganoderenic D và acid ganoderic C1.
Để so sánh hàm lƣợng triterpenoid trong thể quả và bào tử của G.lucidum, một chƣơng trình HPLC đƣợc xây dựng với pha động ethanol 2% –acetonitril (4:6), phân tách đƣợc 7 acid ganoderic là acid ganoderic A, B, C1, H, α, β và acid ganolucidic A [50].
GAA trong nấm Linh chi cũng đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC – PAD pha đảo rửa giải isocratic với các điều kiện sắc ký gồm: cột RP 18 (100 x 4,6 mm; 4 µm); pha động acetonitril – acid acetic 1% (30 : 70), bƣớc sóng phát hiện 254 nm, nhiệt độ cột 30°C, tốc độ dòng 1,5 ml/phút [18].
Chƣơng trình HPLC đẳng dòng pha động gồm acetonitril, nƣớc và acid formic (42:58:0.5, v/v/v), cột Agilent Zorbax XDB C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) cho giới hạn phát hiện GAA là 3,0 ng/ml và giới hạn định lƣợng là 20,0 ng/ml [53].
Theo Da J. và cộng sự [28], đã chọn GAA là chuẩn đối chiếu để phân tích các thành phần triterpen khác trong G.lucidum do có hàm lƣợng cao trong G.lucidum, phân tách dễ, và tƣơng đối ổn định.
Ngoài ra GAA còn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp miễn dịch học sắc ký [61].
1.4 MỘT SỐ CHỈ TIÊU KHÁC TRONG KIỂM NGHIỆM NẤM LINH CHI 1.4.1 Mô tả 1.4.1 Mô tả
Thể quả hình thận, hình tròn hay hình quạt, hóa gỗ, cứng, đƣờng kính 5 cm đến 18 cm, dày 1 cm đến 2 cm. Mặt trên màu nâu vàng đến nâu đỏ, bóng loáng nhƣ đánh vecni, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép mỏng, nhẵn, hơi lƣợn sóng, Mặt dƣới màu vàng nâu đến nâu nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Phần trong xốp, màu trắng đến nâu nhạt. Cuống hình trụ, đính lệch, có khi phân nhánh dài 6 cm đến 10 cm, đƣờng kính 1 cm đến 3,5 cm, màu nâu đỏ đến nâu đen. Màu thơm nhẹ, vị đắng [2].
1.4.2 Bột
Bột màu vàng nâu. Soi bột dƣới kính hiển vi thấy: Sợi nấm rải rác hoặc tụ thành đám, không màu hoặc nâu nhạt, mảnh, hơi cong, phân nhánh, đƣờng kính 2,5 µm đến 6 µm. Bào tử hình trứng, màu nâu, đứng riêng lẻ hay tụ thành đám, dài 8 µm
đến 12 µm, rộng 5 µm đến 8 µm, đỉnh trơn nhẵn, lớp vỏ ngoài không màu, lớp vỏ trong có nhiều chỗ lồi ra [2].
1.4.3 Định tính
A. Lấy 2 g bột dƣợc liệu, thêm 20 ml EtOH 96 %, đun sôi hồi lƣu 1 giờ, lọc. Nhỏ vài giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc, sấy nhẹ cho khô, phun hỗn hợp dung dịch sắt (III) clorid 0,9 % và dung dịch kali fericyanid 0,6 % theo tỷ lệ 1:1, sẽ có màu xanh lơ [2].
B. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
Bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam, Dƣợc điển Trung Quốc, Dƣợc điển dƣợc liệu Mỹ (AHP) và Dƣợc điển Mỹ đều sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng để định tính nấm Linh chi [2], [58], [20], [67].
Bảng 1.1: Phân tích TLC trong bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam và dƣợc điển Trung Quốc
Bản bổ sung Dƣợc điển Việt
Nam [2] Dƣợc điển Trung Quốc [58] Bản (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mỏng Silicagel G Silica gel G Dung
môi khai triển
Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C)- ether ethylic – acid formic (15 : 5 : 1)
Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ethyl format – acid formic (15 : 5 : 1);
Dung dịch thử
Lấy 2 g bột thô dƣợc liệu, thêm 30 ml methanol, đun hồi lƣu trong 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol
Lấy 2g bột dƣợc liệu, thêm 30ml methanol, đun hồi lƣu trong 30 phút, lọc, bốc hơi dịch lọc tới cắn. Hòa tan cắn trong 2ml methanol
Dung dịch đối
chiếu
Lấy 2 g bột thô Linh chi (mẫu chuẩn) tiến hành chiết nhƣ mẫu thử
Lấy 2g bột nấm Linh chi (mẫu chuẩn), tiến hành chiết nhƣ mẫu thử.
Tiến hành
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 10 cm đến 12 cm, lấy bản mỏng để khô trong không khí, quan sát dƣới đèn tử ngoại, bƣớc sóng 366 nm
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 4 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng , quan sát dƣới tia UV bƣớc sóng 365 nm.
Yêu cầu
Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết giống với các vết của dung dịch đối chiếu về màu sắc và vị trí (có ít nhất 4 vết phát quang màu vàng ánh xanh)
Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf, với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu
Bảng 1. 2:Phân tích TLC trong Dƣợc điển dƣợc liệu Mỹ (AHP) và Dƣợc điển Mỹ Dƣợc điển dƣợc liệu Mỹ (AHP) [20] Dƣợc điển Mỹ [67] Bản mỏng Bản mỏng HPTLC 10 x 10 cm hoặc 20 x 10 cm, silica gel 60 Bản mỏng HPTLC Dung môi khai triển Dichloromethan – methanol (9:1)
Toluen – ethyl format – acid formic (5 : 5 : 0,2).
Dung dịch thử
Siêu âm 250 mg bột thuốc trong 5 ml methanol trong 5 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc đến cắn. Hòa cắn trong 3 ml methanol
Siêu âm khoảng 1,0 g bột mịn nấm Linh chi trong 50 ml EtOH trong 15 phút, ly tâm, phần dịch đƣợc bốc hơi đến cắn. Hòa cắn trong 2ml EtOH.
Dung dịch
đối chiếu Không có
-Dung dịch chuẩn A: 1,0 mg acid ganoderic A/EtOH
- Dung dịch chuẩn B: 0,3 mg/ml ergosterol/ EtOH
- Dung dịch chuẩn C: 50 mg/ml nấm
G.lucidum trong EtOH
Thuốc thử H2SO4 10%/ MeOH H2SO4 10%/ EtOH
Tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 7 cm
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 2 µl dung dịch A và B, 4 µl dung dịch C và dung dịch thử. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 7 cm
Yêu cầu
Khi quan sát ở bƣớc sóng 366 nm, sắc ký đồ của dung dịch thử có 6 vết giống với sắc ký đồ của dung dịch chuẩn C về màu sắc và Rf.
Ở ánh sáng thƣờng, mẫu thử có vết màu xanh tím trùng với Rf của acid ganoderic A; 2 vết tím đỏ, 1 vết xanh tím ở giữa sắc ký đồ, 2 vết màu tím, trong đó có 1 vết trùng với Rf của ergosterol
1.4.4 Độ ẩm
Yêu cầu không quá 17,0% [1], [58]
1.4.5 Tro toàn phần
Yêu cầu không quá 3,0 % [1], không quá 3,2 % [58]
1.4.6 Tro không tan trong acid
Yêu cầu không quá 0,5 % [1], [58]
1.4.7 Chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu
Yêu cầu: Không ít hơn 3,0 % tính theo dƣợc liệu khô kiệt [1], [58].
1.4.8 Tạp chất
Yêu cầu:
- Arsen: không vƣợt quá 3,0 µg/g - Cadmium: không vƣợt quá 0,5 µg/g - Chì: không vƣợt quá 5,0 µg/g
- Thủy ngân: không vƣợt quá 0,2 µg/g
- Vi sinh vật: tổng lƣợng vi khuẩn hiếu khí không vƣợt quá 105 cfu/g; tổng số lƣợng nấm mốc và nấm men không vƣợt quá 103 cfu/g; vi khuẩn Gram âm không vƣợt quá 103 cfu/g và không có vi khuẩn Salmonella và Escherichia coli. [58]
1.5 MỘT VÀI NÉT VỀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.5.1 Phƣơng pháp HPTLC 1.5.1 Phƣơng pháp HPTLC
Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng đƣợc dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lƣợng hoặc định lƣợng hoạt chất thuốc [10].
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ đƣợc chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, đƣợc trải thành lớp mỏng đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển trên lớp mỏng, theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu đƣợc là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng
thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động [10].
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi [10]:
Trong đó:
a là khoảng cách di chuyển của chất phân tích;
b là khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu. Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
Ngoài ra, khi sắc ký liên tục không xác định đƣợc tuyến dung môi, vị trí vết chất thử trên sắc đồ có thể xác định bằng hệ số dịch chuyển tƣơng đối Rr. Hệ số dịch chuyển tƣơng đối Rr đƣợc xác định bằng tỷ số giữa khoảng cách dịch chuyển của vết chất thử và khoảng cách dịch chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu đƣợc sắc ký trong cùng điều kiện và trên cùng bản mỏng với mẫu thử [10]:
Trong đó:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử; c là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết chất chuẩn. Giá trị Rr có thể lớn hay nhỏ hơn 1.
Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức nâng cao của TLC. HPTLC đƣợc điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đƣa ra. Trong đó, các thông số của quá trình phân tích đƣợc ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao. Các bƣớc của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết đƣợc tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích. Quá trình phun mẫu đƣợc tiến hành tự động hoặc bán (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b a f R c a r R
tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxi hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa. Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm đƣợc kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lƣợng.
Hiện nay để tăng cƣờng độ tin cậy của kết quả phân tích, ngƣời ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates). Bản này đƣợc tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thƣớc hạt 5µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân giải đƣợc tăng cƣờng vì vết sắc kí nhỏ, thời gian sắc kí ngắn hơn và lƣợng dung môi ít hơn so với TLC.
1.5.2 Phƣơng pháp HPLC
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất này ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên [4], [10].
Kết quả của quá trình tách các chất đƣợc detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt đƣợc tách ra trên sắc đồ. Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố lỏng – lỏng, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký pha liên kết, sắc ký gel. Trong đó sắc ký phân bố đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay[4], [10].
Máy HPLC gồm các bộ phận sau: hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể đƣợc sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị). Pha động đƣợc cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thƣờng với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector [4], [10].
Sau đây là một số thông số đặc trƣng của kỹ thuật HPLC:
Thời gian lưu tR (phút)
Thời gian lƣu t R là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lƣu là đại lƣợng để phát hiện định tính các chất.
Hệ số dung lượng k ’
Hệ số dung lƣợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2 pha và đƣợc tính theo sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lƣợng chất tan trong pha tĩnh và lƣợng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
Độ chọn lọc α
Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A, B có kA’ và kB’ khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc α (α từ 1,5 đến 2,0 là tối ƣu). Nếu α quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài.
Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa (H)
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký nhƣ là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động học, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học đƣợc thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.
Độ phân giải R
Độ phân giải biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Trong thực tế nếu các pic cân đối (Gauss) thì để 2 pic có độ lớn bằng nhau đƣợc coi là tách ra khỏi nhau hoàn toàn thì độ phân giải tối thiểu phải là 1,5.
Hệ số bất đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ thu đƣợc. T đƣợc tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao pic.