1.5.1 Phƣơng pháp HPTLC
Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng đƣợc dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lƣợng hoặc định lƣợng hoạt chất thuốc [10].
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ đƣợc chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, đƣợc trải thành lớp mỏng đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển trên lớp mỏng, theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu đƣợc là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng
thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động [10].
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi [10]:
Trong đó:
a là khoảng cách di chuyển của chất phân tích;
b là khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu. Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
Ngoài ra, khi sắc ký liên tục không xác định đƣợc tuyến dung môi, vị trí vết chất thử trên sắc đồ có thể xác định bằng hệ số dịch chuyển tƣơng đối Rr. Hệ số dịch chuyển tƣơng đối Rr đƣợc xác định bằng tỷ số giữa khoảng cách dịch chuyển của vết chất thử và khoảng cách dịch chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu đƣợc sắc ký trong cùng điều kiện và trên cùng bản mỏng với mẫu thử [10]:
Trong đó:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử; c là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết chất chuẩn. Giá trị Rr có thể lớn hay nhỏ hơn 1.
Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức nâng cao của TLC. HPTLC đƣợc điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đƣa ra. Trong đó, các thông số của quá trình phân tích đƣợc ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao. Các bƣớc của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết đƣợc tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích. Quá trình phun mẫu đƣợc tiến hành tự động hoặc bán
b a f R c a r R
tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxi hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa. Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm đƣợc kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lƣợng.
Hiện nay để tăng cƣờng độ tin cậy của kết quả phân tích, ngƣời ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates). Bản này đƣợc tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thƣớc hạt 5µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân giải đƣợc tăng cƣờng vì vết sắc kí nhỏ, thời gian sắc kí ngắn hơn và lƣợng dung môi ít hơn so với TLC.
1.5.2 Phƣơng pháp HPLC
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất này ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên [4], [10].
Kết quả của quá trình tách các chất đƣợc detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt đƣợc tách ra trên sắc đồ. Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố lỏng – lỏng, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký pha liên kết, sắc ký gel. Trong đó sắc ký phân bố đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay[4], [10].
Máy HPLC gồm các bộ phận sau: hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể đƣợc sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị). Pha động đƣợc cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thƣờng với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector [4], [10].
Sau đây là một số thông số đặc trƣng của kỹ thuật HPLC:
Thời gian lưu tR (phút)
Thời gian lƣu t R là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lƣu là đại lƣợng để phát hiện định tính các chất.
Hệ số dung lượng k ’
Hệ số dung lƣợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2 pha và đƣợc tính theo sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lƣợng chất tan trong pha tĩnh và lƣợng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
Độ chọn lọc α
Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A, B có kA’ và kB’ khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc α (α từ 1,5 đến 2,0 là tối ƣu). Nếu α quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài.
Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa (H)
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký nhƣ là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động học, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học đƣợc thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.
Độ phân giải R
Độ phân giải biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Trong thực tế nếu các pic cân đối (Gauss) thì để 2 pic có độ lớn bằng nhau đƣợc coi là tách ra khỏi nhau hoàn toàn thì độ phân giải tối thiểu phải là 1,5.
Hệ số bất đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ thu đƣợc. T đƣợc tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao pic. Trong phép định lƣợng yêu cầu 0,8 ≤ T ≤ 2,0. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.5.3 Phƣơng pháp quang phổ UV – VIS
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến còn đƣợc gọi là phƣơng pháp quang phổ hấp thụ điện tử, là một trong các phƣơng pháp phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện từ [10].
Xác định độ hấp thụ
Độ hấp thụ A của một dung dịch là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền quang T khi cho ánh sáng đơn sắc đi qua. Nó đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình: 1 I0
A = Log10 = Log10
T I Trong đó:
I là cƣờng độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch; Io là cƣờng độ ánh sáng đơn sắc tới;
T là độ truyền quang.
Ngoại trừ sự có mặt của các yếu tố lý - hóa học khác, độ hấp thụ A tỷ lệ với độ dài quang trình d của ánh sáng truyền qua dung dịch (bề dày lớp dung dịch) và nồng độ c của dung dịch chất khảo sát. Sự phụ thuộc này đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình [10].:
A = c d
Trong đó là độ hấp thụ mol, d đƣợc biểu thị bằng cm và c biểu thị bằng mol/lít. Độ hấp thụ của dung dịch chất tan ở nồng độ 1% (kl/tt) hay 10 g/l trong một cốc đo có chiều dày 1 cm và đo ở một bƣớc sóng xác định là độ hấp thụ riêng của chất tan và đƣợc ký hiệu là A (1 %, 1 cm). Độ hấp thụ riêng của chất tan đƣợc tính bằng công thức [10]:
A (1%, 1 cm) = M M là khối lƣợng phân tử của chất thử.
Độ hấp thụ riêng của một chất trong một dung môi xác định và đo ở một bƣớc sóng xác định là một đặc tính của chất đó.
Thiết bị
Máy quang phổ thích hợp dùng cho việc đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến bao gồm một hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 nm đến 800 nm và một thiết bị phù hợp để đo độ hấp thụ. Hai cóng đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu cần phải có đặc tính quang học nhƣ nhau. Khi đo trên máy tự ghi hai chùm tia, cốc đựng dung dịch đối chiếu đƣợc đặt ở bên có chùm tia đối chiếu đi qua [10].
Từ những kết quả tham khảo các tài liệu về tiêu chuẩn kiểm nghiệm nấm Linh chi của các Dƣợc điển trên thế giới và của Việt Nam (bản bổ sung) cùng những tổng quan về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của nấm Linh chi, nhóm nghiên cứu đề xuất một số chỉ tiêu phục vụ kiểm nghiệm nấm Linh chi nhƣ sau:
1. Chỉ tiêu mô tả đặc điểm dƣợc liệu, đặc điểm bột dƣợc liệu 2. Chỉ tiêu định tính: sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng 3. Chỉ tiêu định lƣợng:
+ Định lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi bằng phƣơng pháp đo quang phổ UV-VIS
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Nấm Linh chi trồng và thu hái tự nhiên tại các tỉnh Quảng Nam, Tây Nguyên, Thanh Hóa, Bình Định, Đồng Nai. Tên khoa học của cây đƣợc xác định là
Ganoderma lucidum. Ngoài ra, thu thập mẫu nấm Linh chi Hàn Quốc để nghiên cứu định tính. Các mẫu nấm đƣợc xay thành bột thô theo quy định của dƣợc điển Việt Nam.
Bảng2..1: Các mẫu nấm Linh chi nghiên cứu
Ký hiệu Nguồn gốc Thời điểm thu mẫu
Nấm trồng
GLT – 1 Đại Lộc, Quảng Nam 10/2016
GLT – 2 Đại Lộc, Quảng Nam 10/2016
GLT – 3 Đại Lộc, Quảng Nam 10/2016
GLT – 4 Đại Lộc, Quảng Nam 10/2016
GLT – 5 Quảng Nam 10/2016 GLT – 6 Tây Nguyên 11/2016 GLT – 7 Tây Nguyên 11/2016 GLT – 8 Thanh hoá 10/2016 GLT – 9 Bình Định 01/2017 Nấm tự nhiên
GLN – 1 Tiên Phƣớc, Quảng Nam 10/2016 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
GLN – 2 Quảng Ninh 10/2016
GLN – 3 Cát Tiên, Đồng Nai 07/2016
Mẫu nấm Hàn Quốc
2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI
- Chất chuẩn đối chiếu: Acid ganoderic A (số lô Gan01/0-8/14) do Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh cung cấp, hàm lƣợng 98,92%; D-glucose hàm lƣợng 99,5% của Sigma-Aldrich.
- Các hóa chất thuốc thử đạt tinh khiết phân tích (PA) hoặc HPLC: Ether dầu hỏa, diethyl ether, acid formic, dichloromethan, acid acetic 1% (tt/tt), acetonitril (loại HPLC), methanol (loại HPLC), NaHCO3 5%, chloroform, acid hydrochloric 1N, ethanol, phenol, H2SO4 đặc, nƣớc cất…
- Giấy chỉ thị pH, giấy lọc
2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Water với đầu dò PAD, cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), máy quang phổ Shimadzu UV – VIS 2450, hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC Camag, máy ly tâm lạnh Eppendorf 5804R, máy xay dƣợc liệu, cân phân tích Mettler Toledo, bể siêu âm Elmasonic, tủ sấy, nồi cách thủy, tủ lạnh…..
- Dụng cụ thủy tinh các loại: Phễu chiết 100 ml và 250 ml, bình cầu dung tích 1000 ml, bình định mức, cốc các loại, bình tam giác các loại, pipet, lam kính, chày cối sứ….
Máy HPLC Water, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng
Cân phân tích Mettler Toledo XPE 26, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng
Máy quang phổ UV – VIS Shimadzu 2450, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ƣơng
Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5804R, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng
Hình 2.1: Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu
2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Định danh thực vật 2.4.1 Định danh thực vật
Các mẫu Nấm Linh chi sau khi thu hái đƣợc gửi chuyên gia về nấm để định danh thực vật.
Nấm đƣợc sấy khô bằng tủ sấy ở 100°C, bảo quản trong túi nilon kín, tránh ánh sáng và ở điều kiện phòng thí nghiệm.
2.4.2 Mô tả dƣợc liệu
Quan sát mẫu ở ánh sáng thƣờng. Mô tả hình dạng, kích thƣớc, màu sắc và thể chất của dƣợc liệu.
2.4.3 Mô tả đặc điểm bột dƣợc liệu
Sấy khô dƣợc liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 100°C sau đó dùng máy xay và thuyền tán nghiền nhỏ. Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm nƣớc, đặt lam kính lên, đi nhẹ lam kính và quan sát dƣới kính hiển vi vật kính x40 để xác định đặc điểm bột.
2.4.4 Xác định độ ẩm
* Nguyên tắc: Việc xác định độ ẩm đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp khối lƣợng. Cân khối lƣợng nguyên liệu trƣớc và sau khi sấy, khối lƣợng mất sau khi sấy đi đƣợc xem là khối lƣợng nƣớc tự do có trong mẫu, từ đó tính độ ẩm của mẫu.
* Tiến hành: Sấy bì đựng mẫu thử trong tủ sấy ở áp suất thƣờng trong thời gian 30 phút. Cân xác định khối lƣợng bì là m0 (g).
Cân khoảng 1 g bột dƣợc liệu, dàn mỏng, sấy ở nhiệt độ 100°C đến khối lƣợng không đổi. Sau khi sấy làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân ngay. Xác định khối lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy là m’ (g). Xác định thời gian làm khô và giới hạn độ ẩm của nấm Linh chi. Xác định độ ẩm tƣơng đối của nguyên liệu theo công thức sau:
Độ ẩm (%) = m – m’ 100% m – m0
Trong đó:
m0: khối lƣợng cốc cân đã sấy khô đến khối lƣợng không đổi m: khối lƣợng cốc và bột nấm Linh chi trƣớc khi sấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
m’: khối lƣợng cốc và bột nấm Linh chi sau khi sấy đến khối lƣợng không đổi
2.4.5 Định tính nấm Linh chi bằng phƣơng pháp TLC
Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký lớp mỏng nhƣ sau: 1. Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel GF254
2. Pha động: Khảo sát 3 hệ dung môi khai triển nhƣ sau: + Hệ A: Dichloromethan – methanol (9:1)
+ Hệ B: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (15:5:1)
+ Hệ C: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1)
3. Chuẩn bị mẫu:
- Dung dịch thử: Cân khoảng 2 g bột thô dƣợc liệu, thêm 30 ml methanol, đun hồi lƣu 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 2 ml methanol.
- Dung dịch đối chiếu:
+ Dung dịch 1: Cân khoảng 2 g bột thô Linh chi (mẫu nấm đối chiếu) tiến hành chiết nhƣ mẫu thử
4. Thuốc thử: chọn thuốc thử H2SO4 10 %/EtOH
5. Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 10 cm đến 12 cm, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí, quan sát bản mỏng ở bƣớc sóng 254 nm, 366 nm và sau khi phun thuốc thử hiện màu.
- Yêu cầu: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf, với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.