PHƢƠNG PHÁP ĐO QUANG
Nghiên cứu sử dụng dung môi là nƣớc để chiết polysaccharid trong nấm Linh chi. Một số tài liệu tham khảo sử dụng dung môi kiềm, tuy nhiên một số tài liệu tham khảo cũng đã chứng minh khi chiết bằng dung dịch kiềm thì lƣợng polysaccharid thô thu đƣợc có lẫn nhiều tạp hơn. Mặt khác, do tính chất của polysaccharid tan tốt trong nƣớc, do đó lựa chọn dung môi chiết là nƣớc, vừa an toản, rẻ tiền và hiệu quả.
Polysaccharid cho một màu vàng cam khi đƣợc phản ứng với phenol và acid sulfuric đậm đặc. Phản ứng này rất nhạy và màu sắc ổn định trong nhiều giờ, đƣợc xác định ở bƣớc sóng 490 nm. Phản ứng này đƣợc sử dụng để xác định tổng lƣợng polysaccharid thu đƣợc từ Ganoderma lucidum P.Karst tính theo D-glucose. Phƣơng pháp có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác cao có thể sử dụng bổ sung cho phƣơng pháp sử dụng thuốc thử anthron nêu trong dƣợc điển Trung Quốc.
Tuy nhiên phƣơng pháp tạo màu với thuốc thử phenol – acid sulfuric cũng có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng tạo màu nhƣ: thứ tự cho phenol, acid sulfuric và mẫu thử; thể tích phenol 5% và acid sulfuric đậm đặc cũng nhƣ thời gian ủ hỗn hợp phản ứng. Theo nhiều tài liệu tham khảo thì thứ tự mẫu thử - phenol – acid sulfuric cho độ hấp thụ tối đa, đƣợc giải thích là do sự có mặt sẵn phenol trong dung dịch thì khi đƣờng furfural đƣợc tạo thành thì phản ứng tạo màu giữa phenol và đƣờng furfural sẽ xảy ra nhanh chóng trƣớc bất cứ sự cạnh tranh nào hoặc trƣớc khi đƣờng furfural phân hủy. Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến phản ứng tạo màu này. Khi chỉ lắc hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng thì cho độ hấp thụ không ổn định. Tuy nhiên, khi sau khi lắc, đun hỗn hợp phản ứng trong bể cách thủy ở 70°C trong 10 phút thì độ hấp thụ thu đƣợc ổn định hơn và đạt tối đa.
Phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV – VIS làphƣơng pháp phân tích hiện đại đƣợc áp dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm. Phƣơng pháp cho kết quả phân tích nhanh với độ chính xác cao.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã nghiên cứu đƣợc đặc điểm quả thế, đặc điểm bột nấm Linh chi, giới hạn độ ẩm của nấm Linh chi
2. Đã nghiên cứu xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính nấm Linh chi bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC.
3. Đã nghiên cứu xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính, định lƣợng acid ganoderic A trong nấm Linh chi bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC:
- Khảo sát và lựa chọn đƣợc phƣơng pháp chiết acid ganoderic A - Khảo sát và lựa chọn đƣợc các thông số tối ƣu cho quá trình sắc ký:
Cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) Bƣớc sóng phát hiện: 254 nm
Nhiệt độ cột: 30°C
Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút Thể tích tiêm: 20 µl
Thời gian phân tích: 40 phút
Pha động: acetonitril – acid acetic 1% (30:70) Chế độ chạy đẳng dòng
- Phƣơng pháp đã đƣợc thầm định trên điều kiện thiết bị hiện có cho kết quả đáng tin cậy với những thông số sau:
Khoảng tuyến tính: 120 µg/ml đến 400 µg/ml Giới hạn phát hiện: 2,5 µg/ml
Giới hạn định lƣợng: 8,13 µg/ml Độ chính xác (RSD %): < 2% Độ đúng (%): 98% - 102%
4. Đã định lƣợng đƣợc hàm lƣợng acid ganoderic A trong 12 mẫu nấm Linh chi Việt Nam, kết quả cho thấy có 5/12 mẫu không có acid ganoderic A và có 7/12 mẫu có acid ganoderic A với hàm lƣợng từ 0,02 – 0,32%
5. Đã nghiên cứu xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV – VIS và định lƣợng đƣợc hàm lƣợng polysaccharid trong 12 mẫu nấm Linh chi Việt Nam.
KIẾN NGHỊ
Khảo sát thêm hàm lƣợng của các thành phần triterpenoid khác trong nấm Linh chi Việt Nam để có cơ sở xây dựng hàm lƣợng triterpenoid phù hợp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan, Phạm Thị Vân Anh (2005), "Nghiên cứu tác dụng của nấm Linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số lipid máu ở chuột cống", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 38(5).
2. Bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam IV (2015)
3. Bộ Y tế (2013), Dược liệu học, Tập 1, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr. 135 - 139.
4. Bộ Y tế (2013), Hóa phân tích, Tập 2, Nhà xuất bản Y học Hà Nội,
5. Mai Thành Chung, Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2012), "Khảo sát hoạt tính khử gốc tự do superoxid và tác dụng trên glutathion peroxidase trong gan của nấm Linh chi đỏ và nấm Linh chi Vàng", Tạp chí Dược liệu, 17(5), tr. 275 – 281.
6. Nguyễn Thƣợng Dong, Bùi Thị Bằng, Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Trần Mỹ Tiên, Lƣơng Kim Bích, Nguyễn Kim Phƣợng, Đỗ Thị Phƣơng, Nguyễn Thị Phƣơng, Đinh Thị Mai Hƣơng (2006),”Nghiên cứu tác dụng trên trí nhớ của 3 loài nấm linh chi trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopotamin”, Tạp chí Dược liệu, 11(1), tr. 35-40.
7. Nguyễn Thƣợng Dong, Bùi Thị Bằng, Nguyễn Kim Phƣợng, Đỗ Thị Phƣơng, Nguyễn Thị Phƣơng, Đinh Thị Mai Hƣơng (2005), "Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của 3 loài nấm Linh chi trên mô hình gây viêm gan cấp bằng tetraclorur carbon (CCL4)", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr. 192 - 196.
8. Trần Đình Duy, Hà Đức Cƣờng, Nguyễn Đăng Thoại, Trần Mạnh Hùng (2013), "Nghiên cứu tác dụng dự phòng và điều trị suy giảm bạch cầu của cao Linh chi (Ganoderma lucidum) và chế phẩm Linh chi trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng pactitaxel và carboplatin", Tạp chí Dược học, 53(450), tr.15 - 19.
9. Nguyễn Anh Dũng (1995), "Góp phần vào nghiên cứu các thành tố hóa học của
Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst.", Tạp chí Dược học, 229, tr. 14 – 16.
10. Dƣợc điển Việt Nam IV
11. Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Trịnh Văn Tấn (2011), "Nghiên cứu tác dụng tăng cƣờng miễn dịch của nấm Linh chi đỏ trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid", Tạp chí Dược liệu, 16(1+2), tr. 69 - 74.
12. Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam, Tập 1 (Tái bản lần thứ 2), NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 41, 135 - 157.
13. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
14. Nguyễn Phƣơng Đại Nguyên (2013), Nấm Linh chi ở Tây Nguyên, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
15. Trần Thị Văn Thi, Nguyễn Thị Hoài, Lê Trung Hiếu (2012), “Chiết xuất, xác định hàm lƣợng và khảo sát tác dụng dƣợc lý của phân đoạn polysaccharid từ nấm linh chi nuôi trồng tại Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Dƣợc học, 52 (433), 18-22.
16. Trần Thị Văn Thi, Nguyễn Thị Hoài, Nguyễn Thị Phƣợng, Lê Trung Hiếu, Lê Lâm Sơn (2012), "Khảo sát một số tác dụng dƣợc lý của phân đoạn triterpenoid từ nấm Linh chi trồng tại Thừa Thiên Huế", Tạp chí Dược liệu, 17(3), tr. 154 - 158.
17. Phạm Bảo Trƣơng và Nguyễn Minh Thủy (2015), “Tối ƣu hóa quá trình trích ly polysaccharide và tannin trong nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum)”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 36 (2015): 21-28.
18. Nguyễn Ngọc Vinh, Lê Thị Thu Cúc, Phan Nhƣ Trúc, Trần Việt Hùng (2016) "Xây dựng quy trình định tính, định lƣợng acid ganoderic A bằng phƣơng pháp HPLC trong nấm Linh chi - Ganoderma lucidum (Leyss ex. Fr.) Karst".
Tạp chí Dược học, 56, 48-51.
19. Kiểm nghiệm 116 dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (2016), Nhà xuất bản y học, 224-226.
Tài liệu tiếng Anh
20. American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium
21. Bao X., Liu C., Fang J., Li X. (2001), "Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst.”,
Carbohydrat Research, 332, 67-74.
22. Bao X., Fang J., Li X. (2001), “Structural characterization and immunomodulating activity of a complex glucan from spores of Ganoderma lucidum”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (11), pp. 2384-2391.
23. Boh B., Berovic M., Zhang J., Zhi-Bin L. (2007), “Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds”, Biotechnology Annual Review, 13, pp. 265-301.
24. Chen N. H., Liu J.W., Zhong J.J. (2010), “Ganoderic acid T inhibits tumor invasion in vitro and in vivo through inhibition of MMP expression”, Pharmacological Reports, 62(1), pp.150-63.
25. Cheng C. R., Yue Q. X., Wu Z. Y., Song X. Y., Tao S. J., Wu X. H., Xu P. P., Liu X., Guan S. H., Guo D. A. (2010), “Cytotoxic triterpenoids from
Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 71, pp. 1579–1585.
26. Cheng P., Chia-Wei Phan, Vikineswary Sabaratnam, Noorlidah Abdullah, Mahmood Ameen Abdulla, Umah Rani Kuppusamy (2013), “Polysaccharides rich extract of Ganoderma lucidum (M.A. Curtis:Fr.) P. Karst accelerates wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013, pp.9.
27. Chen Y., Yan Y., Xie M.Y., Nie S.P., Liu W., Gong X.F., Wang Y.X. (2008), “Development of a chromatographic fingerprint for the chloroform extracts of
Ganoderma lucidum by HPLC and LC-MS.”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 47(3), pp. 469-77.
28. Da J. (2015), “A reproducible analytical system based on the multi-component analysis of triterpene acids in Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 114, pp. 146-54.
29. el-Mekkawy S. , Meselhy R. Meselhy, Norio Nakamura, Yasuhiro Tezuka, Masao Hattori, Nobuko Kakiuchi, Kunitada Shimotohno, Takuya Kawahata, Toru otake (1998), “Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease substances from
Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 49(6), pp.1651-7.
30. Falandysz J. (2008) "Selenium in edible mushrooms.". J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev., 26 (3), 256-299.
31. Gao Y., Tang W., Gao H., Chan E., Lan J., Zhou S. (2004), "Ganoderma lucidum polysaccharide fractions accelerate healing of acetic acid-induced ulcers in rats.". Journal of Medicinal Food, 7 (4), 417-421.
32. Gau J. P., et al. (1990), “The lack of antiplatelet effect of crude extracts from
Ganoderma lucidum on HIV-positive hemophiliacs”, The American Journal of Chinese Medicine, 18, pp. 175 – 179.
33. GoW T. Robert, Dan Li, George W. Sypert, Randall S. Alberte, (2008), “Extracts and methods comprising Ganoderma species”, United States, Patent Application Publication, Pub. No.: US 2008/0112966 A1.
34. Ha Do T., Oh J., Khoi N. M., Dao T. T., Dung le V., Do T. N., Lee S. M., Jang T. S., Jeong G. S., Na M. (2013), “In vitro and in vivo hepatoprotective effect of ganodermanontriol against t-BHP-induced oxidative stress”, Journal of Ethnopharmacology, 150(3), pp. 875-855.
35. Ha D. T., Loan L.T., Hung T.M., Han L.V.N, Nguyen Minh Khoi, Dung L.V., Byung Sun Min, Nguyen N.P.D. (2015), “An improved HPLC-DAD method for quantitative comparisons of triterpenes in Ganoderma lucidum and its five related species originating from Vietnam”, Molecules, 1059-1077.
36. Hajjaj H., et al. (2005), “Effect of 26-oxygenosterols from Ganoderma lucidum
and their activity as cholesterol synthesis inhibitors”, Applied and Environmental Microbiology, 71(7), pp. 3653-3658.
37. Hedge, J.E. and Hofreiter, B.T. (1962). In: Carbohydrate Chemistry, 17 (Eds. Whistler R.L. and Be Miller, J.N.), Academic Press, New York.
38. Huang S. Q. (2010), “Optimization of Alkaline Extraction of Polysaccharides from Ganoderma lucidum and Their Effect on Immune Function in Mice”,
Molecules, 15, pp. 3694-3708.
39. Huie C. W., Di X. (2004), “Chromatographic and electrophoretic methods for Lingzhi pharmacologically active components”, Journal of Chromatography B, 812, pp. 241-257.
40. Iris F. F. Benzie and Sissi Wachtel-Galor (2011), Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects. 2nd edition.
41. Jia J, Zhang X, Hu Y. S, et al. (2009), "Evaluation of in vivo antioxidant activities of Ganoderma lucidum polysaccharides in STZ-diabetic rats". Food Chemistry, 115, 32-36.
42. Jiang J., Slivova V., Harvey K., Valachovicova T., Sliva D. (2004), “Ganoderma lucidum suppresses growth of breast cancer cells through the inhibition of Akt/NF-kappaB signaling”, Nutrition and Cancer, 49(2), pp. 209-216.
43. Jiang J., Slivova V., Valachovicova T., Harvey K., Sliva D. (2004), "Ganoderma lucidum inhibits proliferation and induces apoptosis in human prostate cancer cells PC-3". International Journal of Oncology, 24 (5), 1093- 1099. 50T
44. Jong S.C, Birmingham J. M. (1992), “Medicinal benefits of the mushroom
Ganoderma”, Advances in Applied Microbiology, 37, pp. 101-34
45. Kim H. W. (1997), “Inhibition of cytopathic effect of human immunodeficiency virus-1 by water-soluble extract of Ganoderma lucidum”, Archives of Pharmacal Research, 20, pp. 425-431.
46. Kim K. C., Kim J. S., Son J. K., Kim I. G. (2007), "Enhanced induction of mitochondrial damage and apoptosis in human leukemia HL-60 cells by the
Ganoderma lucidum and Duchesnea chrysantha extracts". Cancer Lett., 246 (1-2), 210-217.
47. Koyama K., Imaizumi T., Akiba M., Kinoshita K., Takahashi K., Suzuki A., Yano S., Horie S., Watanabe K., Naoi Y. (1997), “Antinociceptive components of Ganoderma lucidum”, Planta Medica, 63(3), pp. 224-227.
48. Kubota T. (1982), “Structures of Ganoderic Acid A and B, two new lanostane type bitter triterpenes from Ganoderma lucidum (FR.) Karst.”, Helvetica Chimicacta, 65, 2 (1982), 62.
49. Li B. M., Gu H. F., Li Y., Liu C., Wang H. Q., Kang J., Wu C. H., Chen R. Y.(2012), “Determination of nine triterpenoid acids from Ganoderma lucidum of different producting areas by HPLC”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 37(23), pp. 3599-3603.
50. Li J. (2014), “Study on variation of main ingredients from spores and fruiting bodies of Ganoderma lucidum”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 39(21), pp. 4246-4251.
51. Liu C., Dunkin D., Lai J., Song Y., Ceballos C., Benkov K., Li X. M. (2015), “Anti-inflammatory effects of Ganoderma lucidum triterpenoid in human Crohn's disease associated with downregulation of NF-κB signaling”, Inflamm Bowel Disease, 21(8), pp. 1918-1925.
52. Liu J., Kurashiki K., Fukuta A., Kaneko S., Suimi Y., Shimizu K., Kondo R.(2012), “Quantitative determination of the representative triterpenoids in the extracts of Ganoderma lucidum with different growth stages using high- performance liquid chromatography for evaluation of their 5a-reductase inhibitory properties”, Food Chemistry, 133(3). (***)
53. Liu Y. (2011), “Sensitive and selective liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of five ganoderic acids in
Ganoderma lucidum and its related species”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54(4), pp. 717–721.
54. Lu J. (2012), “Quality difference study of six varieties of Ganoderma lucidum
with different origins”, Front Pharmacol, 3, pp. 57.
55. Ma B., Wei Ren, Zhou Y., Ma J., Ruan Y., Wen C. N. (2011), “Triterpenoids from the spores of Ganoderma lucidum”, North American Journal of Medical Sciences, 11(3).
56. Masuko T., Akio Minamib, Norimasa Iwasakib, Tokifumi Majimab, Shin-Ichiro Nishimurac, Yuan C. Leea (2005), “Carbohydrate analysis by a phenol– sulfuric acid method in microplate format”, Analytical Biochemistry, 339 (1), pp. 69–72.
57. Paterson R. R. M. (2006), “Ganoderma – a therapeutic fungal biofactory”,
Phytochemistry, 67, pp. 1985 – 2001.
58. Pharmacopoeia of the people's republic of China (2005).
59. Pillai T. G., Nair C. K., Janardhanan K. K. (2007), “Polysaccharides isolated from Ganoderma lucidum occurring in Southern parts of India, protects radiation induced damages both in vitro and in vivo”, Environmental Toxicology and Pharmacology, 26 (2008), pp. 80–85.
60. Radwan F. F., Perez J. M., Haque A., “Apoptotic and immune restoration effects of Ganoderic Acids define a new prospective for complementary treatment of cancer”, Journal of Clinical & Cellular Immunology, 3.
61. Sakamoto S., Kikkawa N. (2016), “.Immunochromatographic strip assay for detection of bioactive Ganoderma triterpenoid, ganoderic acid A in
Ganoderma lingzhi”, Fitoterapia, 114, pp. 51-55.
62. Sanat K. Saha, Curtis F. Brewer (1993), “Determination of the concentrations of oligosaccharides, complex type carbohydrates, and glycoproteins using the phenol-sulfuric acid method”, Carbohydrate Research, 254 (1994), pp. 157-167.
63. Skalicka-Woźniak K., Janusz Szypowski, Renata Łoś, Marek Siwulski, Krzysztof Sobieralski, Kazimierz Głowniak, Anna Malm (2011), “Evaluation of polysaccharides content in fruit bodies and their antimicrobial activity of four Ganoderma lucidum (W Curt.: Fr.) P. Karst. strains cultivated on different wood type substrates”, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 81(1), pp.17-21.
64. Tanaka S., Ko K., Kiko K., Tsuchiya K., Yamashita A., Murasugi A., Sakuma S., Tsunoo H. (1989), “Complete amino acid sequence of an immunomodulatory protein, ling zhi-8 (LZ-8). An immunomodulator from a fungus, Ganoderma lucidium, having similarity to immunoglobulin variable regions”, The Journal of Biological Chemistry, 264, pp. 16372-16377.
65. Tomasi S., Lohézic-Le Dévéhat F., Sauleau P., Bézivin C., Boustie J. (2004), "Cytotoxic activity of methanol extracts from Basidiomycete mushrooms on murine cancer cell lines". Pharmazie., 59 (4), 290-293.
66. Trigos A., Medellín J. S. (2011), “Bogically active metabolites of the genus
Ganoderma: Three decades of myco-chemistry research”, Revista Mexicana de Micología, 34, pp. 63 – 83.
67.United States Pharmacopeia Convention 2014.
68. Xu Z., Xiuping Chen, Zhangfeng Zhong, Lidian Cheny and Yitao Wang, Zengtao X., (2011), “Ganoderma lucidum Polysaccharides: Immunomodulation and Potential Anti-Tumor Activities’, The American Journal of Chinese Medicine, 39(1), pp. 15–27.
69. Yu-Hong Y., Zhi-Bin L. (2002), “Protective effects of Ganoderma lucidum
polysaccharides peptide on injury of macrophages induced by reactive oxygen species”, Acta Pharmacologica Sinica, 23 (9), pp. 787-791.
70. Yuanfeng W., et al. (2010), “Determination of tea polysaccharides in Camellia sinensis by a modified phenol-sulfuric acid method”, Archives of Biological Sciences, 62 (2), 669-676.