c) Phương pháp
4.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn
Mười chín dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường PDA được chọn khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ từ nitơ tự do sau 2, 4 và 6 ngày (sau khi chủng trong môi trường NFb lỏng, không N, không Yeast extract). Sau hai ngày chủng vi khuẩn, cả 19 dòng đều có khả năng tổng hợp đạm tùy theo dòng và có xu hướng giảm dần từ ngày 2
đến ngày 6. Đây là xu hướng chung của hầu hết các dòng vi khuẩn vì sau khi chủng, các dòng vi khuẩn chưa kịp thích ứng với môi trường nên khả năng tạo nên hàm lượng đạm thấp, đến ngày thứ 4 sau khi đã bắt đầu quen với môi trường, chúng sinh trưởng và phát triển mạnh nên khả năng tổng hợp đạm cao hơn. Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, khi đã phát triển ở mức tối đa, mật số vi khuẩn ngày càng tăng nhưng chất dinh dưỡng trong môi trường để sử dụng có giới hạn nên các dòng vi khuẩn đã sử dụng lượng đạm mà chúng đã tổng hợp làm hàm lượng đạm giảm đi đáng kể.
Hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn cố định được trình bày ở bảng 10.
Bảng 10. Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn
STT Dòng vi khuẩn
Hàm lƣợng NH4+
trung bình (µg/mL)
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
1 H01 0,17b 0,07cd 0,06e 2 H02 0,17b 0,05d 0,10bcde 3 H03 0,17b 0,10bcd 0,09cde 4 H04 0,20b 0,05d 0,15abcd 5 H05 0,16b 0,19ab 0,21a 6 H06 0,17b 0,05d 0,17abc 7 H07 0,17b 0,20ab 0,11bcde 8 H08 0,18b 0,23a 0,07de 9 H09 0,22b 0,19ab 0,12bcde 10 H10 0,18b 0,17ab 0,18ab 11 H11 0,22b 0,18ab 0,04e 12 H12 0,28b 0,19ab 0,05e 13 H13 0,19b 0,14abcd 0,04e 14 H14 0,25b 0,14abcd 0,05e 15 H15 0,54a 0,13abcd 0,06e
16 H16 0,30b 0,13abcd 0,09cde 17 H17 0,17b 0,14abcd 0,07de
18 H18 0,19b 0,18ab 0,06e
19 H19 0,19b 0,15abc 0,10bcde
CV(%) 44,21 43,97 53,26
Ghi chú: Các trị trung bình theo sau các mẫu tự giống nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở 5%
Sau khi chủng 2 ngày, 19 dòng vi khuẩn ở rễ, thân , lá đều có khả năng tổng hợp đạm. Dòng tổng hợp cao nhất là H15 (0,54 µg/mL) khác biệt có ý nghĩa với các dòng khác, dòng vi khuẩn này thích ứng với môi trường nhanh nên sinh trưởng, phát triển và tạo ra lượng đạm cao. Các dòng khác do chưa thích ứng với môi trường mới nên phát triển chậm và tạo ra lượng đạm thấp hơn.
Đến ngày 4, các dòng vi khuẩn sử dụng hết đạm trong môi trường nên chúng bắt đầu tổng hợp đạm nên lượng đạm có xu hướng giảm dần so với ngày 2. Dòng H08 tổng hợp lượng đạm nhiều nhất, khác biệt có ý nghĩa với các dòng còn lại, tổng hợp được 0,23µg/mL nhưng khác biệt không ý nghĩa với dòng H07, H09 - H12 và H18. Dòng tổng hợp đạm thấp nhất là H06 (0,05 µg/mL).
Ngày 6 sau khi chủng, lượng đạm do các dòng vi khuẩn tổng hợp được giảm mạnh. Lượng chất dinh dưỡng không còn đủ để duy trì sự sống cho các dòng vi khuẩn nên chúng đã sử dụng chính lượng NH4+ do chúng tạo ra. Bên cạnh đó do môi trường nuôi không còn thuận lợi như trước (lượng chất dinh dưỡng giảm và có nhiều chất thải) nên nhiều tế bào vi khuẩn chết. Tổng hợp lượng đạm thấp nhất là dòng H13 (0,04 µg/mL). Một số dòng phát triển chậm, ở ngày 6 vẫn còn tăng trưởng và phát triển nên vẫn chưa sử dụng lượng đạm mà chúng đã tổng hợp. Cụ thể dòng H05 có khả năng tổng hợp đạm cao nhất là 0,21 µg/mL và H10 là 0,18 µg/mL, 2 dòng này khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê nhưng khác biệt với các dòng khác.
Sau 2, 4, 6 ngày chủng vi khuẩn có thể chọn ra một số dòng triển vọng. Dòng H15 (tổng hợp đạm cao nhất ngày 2), H08 (tổng hợp đạm trung bình ngày 2 và cao nhất ở ngày 4) và H05 (tổng hợp đạm trung bình ngày 4 và cao nhất ngày 6) (Bảng 10)
Khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn triển vọng
Ngày 2 sau khi chủng, cả 3 dòng đều tổng hợp đạm nhưng dòng vượt trội nhất là H15 (0,54 µg/mL) (Hình 10), dòng này sinh trưởng và phát triển nhanh nên tổng hợp đạm cao nhất. Các dòng khác chưa thích ứng với môi trường, đồng thời trong môi trường còn đạm nên vi khuẩn sử dụng và chưa tổng hợp nhiều. Đến ngày 4,dòng H15 tổng hợp đạm thấp nhất (0,13 µg/mL) do chúng phát triển nhanh nên chất dinh dưỡng trong môi trường giảm, chúng bắt đầu sử dụng lượng đạm đã tổng hợp được. Các dòng khác đã thích ứng với môi trường. Dòng H08 tổng hợp đạm cao nhất (0,23 µg/mL) nhưng khác biệt không ý nghĩa với dòng H05. Sáu ngày sau khi chủng, 2 dòng H08 và H15 đã sử dụng lượng đạm mà chúng tổng hợp được nên lượng đạm trong môi trường còn rất ít. Dòng H05 sinh trưởng chậm nên đến ngày 6 mới tổng hợp được nhiều đạm nhất (0,21 µg/mL), nếu tăng thời gian, khi chúng phát triển tới mức nhất định sẽ giảm lượng đạm xuống do hết chất dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật chết. Các dòng vi khuẩn tổng hợp đạm cao vào những ngày khác nhau sau khi chủng có thể ứng dụng cho cây trồng tùy vào mục đích sử dụng.
Tóm lại, trong số 19 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, 3 dòng H05, H08 và H15 có khả năng cố định đạm mạnh. Theo kết quả nghiên cứu của Tô Hoàng Diễm
Hình 10: Lƣợng đạm (µg/mL) do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra
b b b a a de a abcd e
(2013), các dòng vi khuẩn triển vọng R6, T3, L4, L5 và L6 nội sinh trong cây cúc mui tổng hợp được lượng amonium dao động từ 0,213 µg/ml - 0,221 µg/ml. Dòng T01 nội sinh trong cây diệp hạ châu cố định được 0,208 µg/ml (Nguyễn Bá Tân, 2013). Trong nghiên cứu khác của Phạm Thanh Sang (2014), dòng TS7 nội sinh trong cây diếp cá có khả năng cố định được 3,3 µg/ml. Điều này cho thấy khả năng cố định đạm tùy thuộc vào từng loại vi khuẩn nội sinh ở mỗi cây khác nhau.
4.4 Khảo sát khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) của các dòng vi khuẩn
Sau khi khảo sát khả năng hòa tan lân và cố định đạm của 19 dòng vi khuẩn đã phân lập được, tiếp tục nuôi cấy trong môi trường Nfb lỏng không bổ sung Tryptophan, không N, không Yeast extract để theo dõi và đo hàm lượng IAA được tạo ra. Kết quả cả 19 dòng đều có khả năng tạo IAA mà không cần bổ sung Tryptophan vào môi trường nuôi (tiền chất tổng hợp IAA). Nhìn chung các dòng chia thành 2 nhóm rõ rệt (nhóm có xu hướng tăng dần IAA từ ngày 2 đến ngày 6 và nhóm giảm ngày 4 nhưng tăng ngày 6) và có 1 dòng tổng hợp IAA giảm dần (Bảng 12).
Bảng 11. Khả năng tổng hợp IAA ở các dòng vi khuẩn phân lập
STT Dòng vi khuẩn
Hàm lƣợng IAA trung bình (µg/mL) Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
1 H01 2,55bc 2,65abcd 3,48ab 2 H02 0,35g 2,46abcd 2,63efg 3 H03 1,22ef 2,23cdef 2,76defg 4 H04 2,48bc 1,88ef 3,07bcde 5 H05 2,52bc 2,44abcd 3,26abcd 6 H06 3,17a 2,68abcd 2,48g 7 H07 2,52bc 2,90a 2,87cdefg 8 H08 2,04cd 2,42abcd 2,56fg 9 H09 2,87ab 2,64abcd 3,44ab 10 H10 2,29c 2,33bcde 3,37abc 11 H11 2,83ab 2,77ab 3,04bcdef
12 H12 2,97ab 2,71abc 2,78defg 13 H13 2,94ab 2,23cdef 2,72efg 14 H14 1,03f 2,80ab 3,65a 15 H15 2,26c 2,75abc 3,24abcd 16 H16 1,73de 2,28bcde 3,30abc 17 H17 3,09a 2,17def 2,59efg 18 H18 2,20cd 1,71f 2,91cdefg 19 H19 2,16cd 2,28bcde 2,48g CV(%) 14,05 12,98 10,48
Ghi chú: Các trị trung bình theo sau các mẫu tự giống nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở 5%
Vào ngày 2, các dòng vi khuẩn vẫn chưa thích nghi với điều kiện sống, đồng thời trong môi trường vẫn còn Tryptophan (tiền chất tổng hợp IAA) được cho vào trong quá trình tăng sinh nên lượng IAA do vi khuẩn tổng hợp được còn thấp. Nhưng vẫn có một số dòng tăng trưởng nhanh nên IAA được tổng hợp cao, cụ thể như dòng H06 (3,17 µg/mL)và H17 (3,09 µg/mL), 2 dòng này khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng khác. Dòng tổng hợp IAA thấp nhất là H14 (1,03 µg/mL).
Ngày 4 sau khi chủng, dòng H6 và H14 giảm lượng IAA so với ngày 2, có thể vi khuẩn đã sử dụng hết Tryptophan trong môi trường và tổng hợp nên lượng IAA mới. Một số dòng khác đang trong thời gian tăng trưởng của vi khuẩn nên tổng hợp lượng IAA cao hơn ngày 2. Dòng H07 tổng hợp IAA cao nhất (2,90 µg/mL) khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng khác và thấp nhất là dòng H18 (1,71 µg/mL).
Đến ngày 6, một số dòng vi khuẩn đã vào pha suy vong (lượng dinh dưỡng trong môi trường không còn đủ) nên IAA được tổng hợp ít hơn. Một số dòng vi khuẩn khác do sinh trưởng và phát triển chậm nên đến ngày 6 vi khuẩn tăng trưởng mạnh tổng hợp được lượng IAA nhiều hơn. Dòng H14 tổng hợp IAA cao nhất là 3,65 µg/mL, khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với các dòng khác. Thấp nhất là dòng H6 và H19 đều có IAA là 2,42 µg/mL.
Sau 2, 4, 6 ngày chủng, có thể chọn được một số dòng triển vọng: H06, H17 (2 dòng này tổng hợp IAA cao vào ngày 2), H07 (tổng hợp IAA cao nhất
vào ngày 4) và H14 (tổng hợp IAA cao nhất vào ngày 6). Trong số 19 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA, chọn 4 dòng triển vọng.
Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của môt số dòng vi khuẩn triển vọng
Ngày 2 sau khi chủng, cả 4 dòng đều tổng hợp IAA nhưng 2 dòng vượt trội nhất là H06 (3,17 µg/mL) và H17 (3,09 µg/mL) (Hình 11), 2 dòng này khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê nhưng khác biệt có ý nghĩa với các dòng khác. Điều này là do 2 dòng này sinh trưởng và phát triển nhanh nên tổng hợp được IAA cao nhất. Các dòng khác chưa thích ứng với môi trường, đồng thời trong môi trường còn Tryptophan trong quá trình tăng sinh. Dòng tổng hợp thấp nhất là H14 (1,03 µg/mL).
Đến ngày 4,dòng H06 và H17 tổng hợp IAA thấp hơn các dòng khác lần lượt là 2,68 µg/mL và 2,17 µg/mL. Tryptophan đã được vi khuẩn sử dụng hết và vi khuẩn bắt đầu tổng hợp IAA. Các dòng khác đã thích ứng với môi trường. Dòng H07 tổng hợp IAA cao nhất (2,90 µg/mL) khác biệt không ý nghĩa với dòng H06 và H14 nhưng khác biệt có ý nghĩa với dòng H17 là dòng tổng hợp IAA thấp nhất (2,59 µg/mL).
Hình 11: Lƣợng IAA do các dòng vi khuẩn triển vọng tổng hợp
a bc f a abcd a ab efg a cdefg g def
Sáu ngày sau khi chủng, dòng H06 đang vào pha suy vong do chất dinh dưỡng không còn đủ để nuôi tế bào vi khuẩn làm khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn giảm hẳn (2,48 µg/mL). Dòng H14 sinh trưởng chậm nên đến ngày 6 mới đạt mật số vi khuẩn để tổng hợp được nhiều IAA nhất (3,65 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với các dòng khác.
Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Bá Tân (2013) phân lập vi khuẩn nội sinh trên cây diệp hạ châu có dòng T04 tổng hợp được IAA là 3,74 µg/mL. Phạm Thanh Sang (2014) phân lập dòng vi khuẩn RS4 nội sinh trên cây diếp cá tổng hợp được IAA là 3,17 µg/mL. Các kết quả này phù hợp với các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập được từ cây Sả.