Hóa chất dùng để nhuộm Gram vi khuẩn:
+ Iod
+ Fusin
+ Crystal violet
+ Ethanol (cồn) 70%
+ Nước cất hai lần vô trùng
f) Hóa chất thực hiện phản ứng PCR - Nước cất 2 lần đã khử trùng. - PCR buffer. - dNTPs ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP). - Taq polymerase. - DNA vi khuẩn.
- Để nhận diện vi khuẩn nội sinh sống trong cây, sử dụng các đoạn mồi 16S- rDNA (Lane et al., 1991) được thiết kế với trình tự sau:
27F: 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC - 3’ 1492R: 5’ – TACGGTTACCTTGTTACGACT – 3’
Bảng 5. Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μl) Nước cất 2 lần 13,25 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 Mồi xuôi 27F 0,25 Mồi ngược 1492R 0,25 dNTPs 4,0
Taq polymerase (5U/μl) 0,25
DMSO 0,5
DNA vi khuẩn 2,0
Tổng thể tích 25
Ghi chú: thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng)
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh
Đo pH của đất vùng rễ. Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá. Sau đó tách rời rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm rồi làm khô chúng bằng giấy hút ẩm. Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch ethanol 70% (trong 30 giây), dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng.
Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1ml nước cất vô trùng.
Hút 10µL dung dịch nghiền ở trên cấy vào ống nghiệm chứa môi trường PDA bán đặc không bổ sung đạm rồi đem ủ ở 300C để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
Sau khoảng 2 - 3 ngày nuôi, khi thấy môi trường nuôi vi khuẩn xuất hiện một lớp màng mỏng trắng đục (pellicle) cách mặt môi trường bán đặc khoảng 3 - 6mm, lấy
5µL dung dịch nuôi vùng này cấy sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 300C trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập nhiều lần để tách ròng vi khuẩn.
Trữ vi khuẩn đã phân lập ròng trong môi trường PDA có bổ sung đạm (1g KNO3/L).
3.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2002).
Tiến hành chụp hình vi khuẩn nội sinh dưới kính hiển vi điện tử quét JBS 5500 (Nhật) ở độ phóng đại 20.000 lần để thấy rõ hơn hình dạng tế bào, các chiên mao ở đầu và chiên mao bên của vi khuẩn.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
- Nhỏ 10μL nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật. - Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 góc 450 rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để đo kích thước vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính như sau:
- Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính.
- Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10µm.
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau:
- Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh của thước.
thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
- Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. - Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau:
m n
N x *10
x: Trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n = 35
Ta có:
- Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. - Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
- Đếm số khoảng cách thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
- Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2002)
3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh
Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, ta tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
- Hút 10μL nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 700 thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2002).
3.2.4 Xác định khả năng tổng hợp NH4+
a) Nguyên tắc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochlorite hình thành có phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982)
b) Hóa chất
- Chuẩn bị dung dịch KCl2 M: Hòa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nước cất. - Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)4SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 4ml stock (NH4+) để được 200ml, sau cùng được dung dịch 2µg/ml
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nước được 0,5L.
- Hypochloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5L. - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng
c) Tiến hành thí nghiệm:
- Cho 15ml môi trường lỏng NFb, New và Burk vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 1210C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút.
d) Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
- Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5L.
- Pha buffer: cho 1ml NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 5 g NaOH vào 0,5L nước cất.
- Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm
+ Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5ml H2O, 0ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4ml H2O, 1ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3ml H2O, 2ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2ml H2O, 3ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1ml H2O, 4ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0ml H2O, 5ml NH4+, 5ml buffer, 5 ml thuốc thử
- Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
+ Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf.
Hình 4: Sự thay đổi màu của dãy dung dịch đạm theo phƣơng pháp Idophenol Blue 5 4 3 2 1 0
+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Hút 1ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD.
+ Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bước sóng 636nm, sau đó vẽ đồ thị trên Excel có thể tính được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
+ Mỗi mẫu đo được lặp lại 3 lần, sau đó tính giá trị trung bình của 3 lần đo sau ngày 2, ngày 4, ngày 6.
3.2.5 Xác định khả năng hòa tan lân khó tan.
Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa môi trường PDA lỏng thu sinh khối: chủng 1 mL vi khuẩn gốc vào ống falcon 50mL có chứa 20mL môi trường PDA lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007).
Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan.
Hiệu suất hòa tan lân E được tính theo công thức:
Tiến hành thí nghiệm
Dùng micropipet hút 5L dung dịch vi khuẩn từ mỗi ống nghiệm môi trường tăng sinh PDA có bổ sung yeast extract 1% nhỏ lên đĩa môi trường NBRIP. Mỗi đĩa 4 dòng, 3 lần lặp lại.
Quan sát và đo đường kính halo, khuẩn lạc mỗi ngày.
3.2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA
a) Chuẩn bị
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cho 15 ml môi trường lỏng NFb vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 1210C trong 20 phút.
Đường kính halo
E = --- x 100 (Nguyen et al., 1992) Đường kính khuẩn lạc
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng)
b) Hóa chất
- Thuốc thử: 4,5g FeCl3 trong 1lit dd H2SO4 - Buffer
+ Dung dịch A2: 0,136g KH2SO4 trong 100ml nước cất + Dung dịch B2: 0,174g K2HSO4 trong 100ml nước cất.
c) Phương pháp
- Lấy 39ml dung dịch A2, 61ml dung dịch B2 cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH = 7
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. - Ly tâm 5.500 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1 ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham. Thêm 2ml thuốc thử Salkowski R2
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: Cân 0,0016g IAA thương mại hòa tan với 10ml phosphat buffer được nồng độ là 160µg/ml. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80µg/ml.
- Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD có giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 – 40µg/ml.
- Mỗi mẫu đo được lặp lại 3 lần, sau đó tính giá trị trung bình của 3 lần đo sau ngày 2, ngày 4, ngày 6.
0 2,5 5 10 20 30 40 80
- Kết quả đo OD các dòng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp.
3.2.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn
Theo Bauer et al. (1966) về phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc. - Chuẩn bị môi trường PDA đặc.
- Trải vi khuẩn gây bệnh Escherichiacoli (E.coli) hoặc Aeromonas hydrophila
(A.hydrophila) lên bề mặt đĩa môi trường.
- Dùng giấy thấm đường kính 6mm nhúng vào vi khuẩn nuôi đạt mật số từ 107 - 108 tế bào/ml trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trải vi khuẩn gây bệnh (sử dụng E.coli và Aeromonas hydrophila mật số từ 107 - 108 tế bào/ml).
- Ủ 350
C trong 12h – 24h.
- Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn
- Đo đường kính khuẩn lạc và vòng sáng lần lượt qua 3 ngày liên tiếp. Tính đường kính vòng vô khuẩn theo công thức (Hernández et al., 2005): Đường kính vòng vô khuẩn = Đường kính vòng sáng – Đường kính khuẩn lạc
3.2.8 Nhận diện các dòng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn cao để thực hiện kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.
Quy trình trích DNA nhanh (Barberio et al., 1994) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cấy vi khuẩn từ ống trữ ròng lên đĩa Petri chứa môi trường PDA. Ủ 1 - 2 ngày trong tủ ủ ở 30o C. Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf có chứa 20 μl nước cất hai lần.
Đun cách thủy các tuýp ở 95oC trong 10 phút. Sau đó làm lạnh các tuýp trong nước đá xay nhuyễn thời gian 10 phút để phá vỡ tế bào vi khuẩn.
Ly tâm nhẹ hai lần, thu được dịch trích DNA của vi khuẩn.
Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
Bƣớc 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự
sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bƣớc 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi (primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn bắt cặp (annealing).
Bƣớc 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
Chu kỳ trong phản ứng PCR
95oC (Biến tính) 5 phút 95oC (Biến tính) 70 giây
53oC (Gắn mồi) 30 giây lặp lại 30 chu kỳ 72oC (Kéo dài) 90 giây
72oC (Kéo dài) 5 phút
Các sản phẩm sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng PCR được trữ ở 4oC và sẽ tiếp tục được phân tích bằng diện di trên gel agarose 1,2%.
Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây sả, phản ứng PCR gen 16S-rDNA (Lane, 1991) sử dụng đoạn mồi:
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine.