c) Phương pháp
4.5 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các dòng vi khuẩn
Khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Các dòng vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường trải sẵn vi khuẩn Aeromonas hydrophila sau một ngày chủng đa số đều xuất hiện khuẩn lạc, nhưng chỉ có 2 dòng có
vòng sáng (Hình 12), các dòng vi khuẩn chưa thích nghi với môi trường mới và mật số còn ít nên khả năng kháng khuẩn không cao. Các ngày tiếp theo, có thêm một số dòng khác xuất hiện vòng sáng và vòng sáng tăng dần kích thước, các dòng thích nghi với
Hình 12: Vòng kháng khuẩn trên môi trƣờng trải vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Ghi chú: 337 là dòng H16 335 là dòng H14
môi trường mới, hoạt động tốt hơn nên khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila tăng lên (Bảng 12).
Sau một ngày chủng đa số các dòng có xuất hiện khuẩn lạc nhưng chỉ có 2 dòng H16 và H18 tạo vòng sáng có đường kính nhỏ, có thể vi khuẩn vẫn chưa thích nghi với môi trường sống mới nên chưa thể kháng lại vi khuẩn gây bệnh. Dòng H16 (D = 5,00 mm) có sự khác biệt ý nghĩa với dòng H18 (D=2,50 mm).
Ngày chủng thứ 2, dòng H16, H18 tiếp tục gia tăng kích thước khuẩn lạc và vòng sáng, có thêm sự xuất hiện của dòng H13, H14. Vòng sáng của dòng H13 và H16 có
Bảng 12. Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn
STT Dòng
Thời gian ủ
1 ngày 2 ngày 3 ngày
Vòng kháng khuẩn (mm) Vòng kháng khuẩn (mm) Vòng kháng khuẩn (mm) 1 H09 0,00 0,00 5,25bc 2 H13 0,00 6,75a 8,50a 3 H14 0,00 5,00ab 7,50ab 4 H16 5,00a 6,75a 9,00a 5 H18 2,50b 3,00b 3,50c CV% 31,50 14,00 17,00
Ghi chú : Các trị trung bình theo sau các mẫu tự giống nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở 5%
đường kính lớn nhất (D = 6,75 mm), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với dòng H18. Dòng H18 gia tăng kích thước và khuẩn lạc nhưng không đáng kể, có vòng kháng khuẩn bé nhất (D=3,00 mm).
Ngày thứ 3, các dòng H13, H14, H16, H18 tiếp tục gia tăng kích thước khuẩn lạc và vòng sáng, có thêm sự xuất hiện vòng sáng của dòng H09. H13 (D = 8,50 mm) và H16 (D = 9,00 mm) có sự khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê. Dòng có kích thước nhỏ nhất là H18 (D = 3,50 mm).
Sau 3 ngày đo, mặc dù H18 xuất hiện từ ngày 1 nhưng đường kính vòng sáng tăng rất ít, vi khuẩn có khả năng kháng lại A. hydrophila nhưng rất yếu. Dòng H09 đến ngày 3 mới tạo vòng sáng, dòng này lên chậm nhưng tạo vòng sáng khá lớn. Dòng H13 và H16 xuất hiện từ ngày 2, vòng sáng tăng theo thời gian và khác biệt với nhau không ý nghĩa về mặt thống kê. Đến ngày 3, 2 dòng H13 và H16 vẫn tạo được vòng kháng khuẩn mạnh nhất lần lượt là 8,50 và 9,00 mm.
Tóm lại, trong số 5/19 dòng có khả năng kháng lại A. hydrophila, 2 dòng H13 và H16 có khả năng kháng A. hydrophila mạnh nhất. Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thanh Sang (2014) dòng RS4 nội sinh trên cây diếp cá tạo vòng kháng khuẩn trên môi trường trải A. hydrophila là 14,5 mm ở ngày 3, dòng L2 nội sinh trên cây cúc mui tạo vòng kháng khuẩn đối với vi khuẩn A. hydrophila theo nghiên cứu của Tô Hoàng Diễm (2013) sau 3 ngày chủng là 4,75mm. Trong một nghiên cứu khác của Nguyễn Bá Tân (2013), 2 dòng T04 và T09 nội sinh trên cây diệp hạ châu tạo vòng kháng khuẩn trên môi trường trải A. hydrophila là 4 mm sau 3 ngày chủng. Như vậy, 2 dòng H13 và H16 tiềm năng là vi khuẩn nội sinh trên cây sả có khả năng kháng lại vi khuẩn
Khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Escherichia coli
Sau 3 ngày đo, trong số 3 lần lặp lại, chỉ có 1 lần xuất hiện vòng kháng khuẩn ở dòng H19 nhưng rất yếu (Hình 14). Như vậy, các dòng vi khuẩn không đủ mạnh để kháng lại E. coli.
Hình 13: Vòng kháng khuẩn yếu trên môi trƣờng trải E. coli
4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn triển vọng.
Sau khi kiểm tra các đặc tính sinh hóa của 19 dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Chọn 2 dòng vi khuẩn triển vọng nhất đó là dòng H16 và dòng H13 thực hiện kỹ thuật PCR với đoạn mồi 16S-rDNA (Hình 14).
Sau khi đã khuếch đại DNA của các dòng vi khuẩn, chọn 2 dòng vi khuẩn H16 và H13 gửi giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Korea.
Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trình tự tương đồng với các trính tự trên ngân hàng gen kết quả đã cho thấy trình tự của dòng H16 có mức đồng hình 85% với 16S-rRNA của dòng vi khuẩn Bacillus cereus, dòng H13 có mức đồng hình 81% với 16S-rRNA của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium (Bảng 13).
Bảng 13. Kết quả giải trình tự của một số dòng vi khuẩn triển vọng
STT Dòng vi khuẩn Kết quả định danh Độ tƣơng đồng (%)
1 H16 Bacillus cereus 85%
2 H13 Bacillus megaterium 81%
1 2 3
Hình 14: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rDNA
(Ghi chú: 1 : Thang chuẩn . 2,3: Các mẫu thí nghiệm – Kích thước mẫu 1.500bp)
4.6.1 Nhận diện dòng vi khuẩn H16
Kết hợp giữa kết quả giải trình tự và phép thử sinh hóa dòng H16 là Bacillus cereus dòng CCM 2010 đồng hình 85% với dòng Bacillus cereus điều này chứng tỏ
dòng H16 có thể là dòng mới nhưng có quan hệ gần gũi với dòng B. cereus.
Theo nghiên cứu của Ding et al. (2004) chuỗi gen nifH được tìm thấy trong B. cereus và được chứng minh là hữu ích cho việc xác định vi khuẩn cố định đạm. Chúng
có thể thay thế lượng N trong phạm vi từ 37,5 – 65 kg/ha) (Cosico et al., 2003). B. cereus có thể sản xuất siderophores, IAA và được chứng minh có hoạt tính kháng nấm
(Longfei et al., 2011). Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Tuyết Ngân et
al. (2011), Vibrio sp. bị lấn át ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn B. cereus. Ngoài ra,
Toyocerin là một probiotic từ bào tử của B. cereus var toyoi giúp tăng hệ thống miễn dịch, kháng thể và giảm tỷ lệ nhiễm Salmonella ở heo và gia cầm. Trong một nghiên cứu gần đây của Sertaç Argun Kıvanç et.al. (2014), B. cereus phân lập từ kết mạc cho hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi sinh vật chỉ thị như Micrococcus luteus, Staphyloccocus aureus, S. epidermidis, S.hominis, S. lugdunensis, S. warneri, S. haemolyticus, Listeria monocytogenes và Proteus mirabilis. Cũng trong năm đó, Jian
et.al. (2014) đã tìm thấy một nhóm gien mới trong B. cereus mã hóa cerecidins
lantibiotic có khả năng kháng lại một loạt các vi khuẩn Gram dương như
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis và thậm chí Streptomyces. Dòng H16
ngoài những khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA tương tự như trên còn có khả năng kháng mạnh với vi khuẩn A. hydrophila.
4.6.2 Nhận diện dòng vi khuẩn H13
Kết hợp giữa kết quả giải trình tự và phép thử sinh hóa dòng H13 là Bacillus megaterium dòng QM B1551 đồng hình 81% với dòng Bacillus megaterium điều này
chứng tỏ dòng H16 có thể là dòng mới nhưng có quan hệ gần gũi với dòng B. megaterium.
So sánh kết quả nghiên cứu về một số đặc tính tiềm năng của dòng B. megaterium. Trong nghiên cứu của Ding et.al. (2004), B. megaterium được phát hiện
có chứa chuỗi gen nifH có khả năng cố định đạm.Vi khuẩn giúp cân bằng N và P dinh dưỡng trên cây lúa mì (Hesham, 2005). Phân P kết hợp với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium var. phosphaticum giúp hấp thu tốt N, P và K ở lá và rễ, giúp cây trồng
(Han et al., 2006 ). Trong công nghệ sinh học, B. megaterium được ứng dụng trong xử lý môi trường và công nghiệp như sản xuất các enzyme Glucose dehydrogenase, Penicillin aminidase và đặc biệt là β-amylase hay các Biodegration enzymes, ứng dụng trong sản xuất vitamin B12, Oxetanocin, … nhiều ứng dụng trong công nghệ gen và tái tổ hợp (Vary. et al., 2007). Chủng đơn còn được sử dụng cho nghiên cứu trên nhiều lĩnh vực của sinh lý bào tử và cấu trúc màng tế bào (Bunk et al., 2010). Về khả năng kháng khuẩn, trong nghiên cứu của Belma et al. (2002), B. megaterium có khả năng
kháng lại các loại vi khuẩn thử nghiệm như Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Yersinia enterocolitica và Micrococcus flavus. Ngoài ra, thuốc kháng sinh được sản xuất từ vi khuẩn B. megaterium có khả năng kháng với vi khuẩn Staphylococcus aureus (kháng với thuốc kháng sinh methicillin), Leuconostoc mesenteroides (kháng
với thuốc kháng sinh glycopeptide), Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli
(Malanicheva et al., 2012). Dòng vi khuẩn H13 ngoài những khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân tương tự những so sánh trên còn có khả năng kháng mạnh với vi khuẩn A. hydrophila.
4.7 Tổng hợp đặc tính của các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sả.
Từ rễ, thân và lá của các mẫu sả, phân lập được 19 dòng vi khuẩn nội sinh. Các đặc tính của các dòng vi khuẩn được liệt kê trong bảng 14 và bảng 15.
Bảng 14. Tổng hợp khả năng cố định đạm và IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sả
STT Dòng vi khuẩn
Cố định đạm (µg/mL)
Tổng hợp IAA (µg/mL)
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
1 H01 0,17b 0,07cd 0,06e 2,55bc 2,65abcd 3,48ab
2 H02 0,17b 0,05d 0,10bcde 0,35g 2,46abcd 2,63efg
3 H03 0,17b 0,10bcd 0,09cde 1,22ef 2,23cdef 2,76defg
4 H04 0,20b 0,05d 0,15abcd 2,48bc 1,88ef 3,07bcde 5 H05 0,16b 0,19ab 0,21a 2,52bc 2,44abcd 3,26abcd 6 H06 0,17b 0,05d 0,17abc 3,17a 2,68abcd 2,48g 7 H07 0,17b 0,20ab 0,11bcde 2,52bc 2,90a 2,87cdefg 8 H08 0,18b 0,23a 0,07de 2,04cd 2,42abcd 2,56fg 9 H09 0,22b 0,19ab 0,12bcde 2,87ab 2,64abcd 3,44ab 10 H10 0,18b 0,18ab 0,18ab 2,29c 2,33bcde 3,37abc 11 H11 0,22b 0,18ab 0,04e 2,83ab 2,77ab 3,04bcdef 12 H12 0,28b 0,19ab 0,05e 2,97ab 2,71abc 2,78defg
13 H13 0,19b 0,14abcd 0,04e 2,94ab 2,23cdef 2,72efg
14 H14 0,25b 0,14abcd 0,05e 1,03f 2,80ab 3,65a
15 H15 0,54a 0,13abcd 0,06e 2,26c 2,75abc 3,24abcd
16 H16 0,30b 0,13abcd 0,09cde 1,73de 2,28bcde 3,30abc
17 H17 0,17b 0,14abcd 0,07de 3,09a 2,17def 2,60efg
18 H18 0,19b 0,18ab 0,06e 2,20cd 1,71f 2,91cdefg
19 H19 0,19b 0,15abc 0,10bcde 2,16cd 2,28bcde 2,48g
CV(%) 44,21 43,97 53,26 14,05 12,98 10,48
Bảng 15. Tổng hợp đặc tính về khả năng hòa tan lân và kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sả
STT
Dòng
vi khuẩn
Hòa tan lân
(E)
Kháng khuẩn (A. hydrophila)
(mm)
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
1 H01 X 163,74cd 132,6f0g - - - 2 H02 156,67c 193,33bc 188,89bcd - - - 3 H03 X 153,77d 169,05cdef - - - 4 H04 173,33c 198,89bc 174,60cdef - - - 5 H05 X X X - - - 6 H06 241,67a 212,22b 195,56bcd - - - 7 H07 X X X - - - 8 H08 157,78c 165,56cd 153,17defg - - - 9 H09 225,56ab 176,19bcd 190,48bcd - - 5,25bc 10 H10 168,89c 210,48b 180,48cde - - - 11 H11 X X X - - - 12 H12 243,33a 255,00a 226,67ab - - - 13 H13 178,52c 258,89a 172,76cdef - 6,75a 8,50a 14 H14 X X X - 5,00ab 7,50ab 15 H15 X 141,03d 122,13g - - - 16 H16 X 167,46cd 140,00fg 5,00a 6,75a 9,00a 17 H17 201,11abc 206,67b 203,61bc - - - 18 H18 186,67bc 260,00a 260,00a 2,50b 3,00b 3,50c 19 H19 X X X - - - CV(%) 44,21 43,97 53,26 31,50 14,00 17,00
CHƢƠNG V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Từ rễ, thân và lá của các mẫu Sả, phân lập được 19 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA trong đó dòng H05, H08 và H15 là ba dòng có khả năng tổng hợp NH4+ cao nhất. Các dòng H06, H07, H14 và H17 tổng hợp IAA cao nhất trong số 19 dòng vi khuẩn. Trong số 14 dòng hòa tan được lân khó tan, dòng H18 có khả năng hòa tan lân cao nhất. Các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hoà tan lân có thể ứng dụng sản xuất phân vi sinh bón cho cây Sả. 5 dòng kháng được vi khuẩn A. hydrophila, 2 dòng H13 và H16 kháng được A. hydrophila mạnh nhất. Các dòng vi khuẩn kháng với vi khuẩn A. hydrophila có triển vọng ứng dụng để trị bệnh cá do vi khuẩn A. hydrophila gây ra và không có dòng nào kháng với vi khuẩn E. coli.
Kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA, dòng H16 và H13 được nhận diện là
Bacillus cereus và Bacillus megaterium với tỉ lệ đồng hình lần lượt là 85% và 81%
5.2 Đề nghị
Ứng dụng khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA của những dòng vi khuẩn có hiệu quả tốt để sản xuất phân vi sinh, đặc biệt là những dòng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn tốt cần được nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tạo kháng sinh trên những dòng vi khuẩn hoặc nấm gây bệnh khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2002. Giáo trình thực tập vi sinh vật. Nxb. Đại Học Cần Thơ.
Đỗ Tất Lợi. 2000. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nxb. Y Học, trang 688 – 689
Đỗ Thị Hòa và Nguyễn Thị Muội. 2004. Giáo Trình Bệnh Thủy Sản. Nxb. Nha Trang. Giang Minh Tú. 2013. Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Sài đất (Wedelia
chinensis M.) trồng ở tỉnh Vĩnh Long. Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên ngành Vi sinh vật học. Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Lăng Ngọc Dậu, Nguyễn Thị Xuân Mỵ và Cao Ngọc Điệp. 2007. Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillum lipoferum. Tuyển tập báo cáo Khoa học Hội nghị toàn Quốc 2007 Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Nxb. Khoa học chính trị, trang 445-448.
Lê Văn Tạo. 1997. Bệnh do Escherichia coli gây ra. Những thành tựu mới về nghiên cứu phòng chống bệnh ở vật nuôi. Tài liệu giảng dạy sau đại học cho bác sĩ thú y
và kỹ sư chăn nuôi. Viện thú y quốc gia Hà nội, trang 207- 210.
Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly và Huỳnh Xuân Phong. 2011. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn. Tạp chí khoa học. Trường Đại học Cần Thơ 19a: 176 – 184.
Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2007. Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải. Tạp chí khoa học, Đại học Quốc Gia Hà Nội 25: 101 – 106.
Nguyễn Bá Tân. 2013. Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diệp hạ châu mọc hoang
tại Lai Vung – Đồng Tháp. Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên ngành Vi sinh
vật học. Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp. 2012. Giáo trình Vi sinh vật học môi trường. Nxb. Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Hữu Hiệp. 2012. Giáo trình vi khuẩn gram âm. Nxb. Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Lân Dũng. 1983. Thực hành vi sinh vật học. Nxb. Đại học và Trung học
chuyên nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Minh Kế. 2014. Phân lập và khảo sát một số đặc tinh của các dòng vi khuẩn
sống nội sinh trong cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) ở tỉnh Trà Vinh.
Luận văn thạc sĩ Sinh thái học. Khoa khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Như Thành. 1990. Vi sinh học công nghiệp. Nxb. Giáo Dục. Nguyễn Thành Đạt. 1990. Thực hành vi sinh, Nxb Nông Nghiệp.
Nguyễn Trọng Thể. 2004. Chọn lọc và sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas flourescens để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii gây hại trên cây bông vải và cây cà chua. Luận văn thạc sĩ khoa nông nghiệp,
Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Vĩnh Phước. 1978. Vi Sinh Vật Học Thú Y, tập 3. Nxb. Đại học và Trung cấp chuyên nghiệp, Hà Nội.
Phạm Thanh Sang, 2014. Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) ở huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng. Luận văn thạc sĩ Sinh thái học. Khoa Khoa học tự nhiện, trường Đại học Cần Thơ.
Phạm Thị Tuyết Ngân, Vũ Ngọc Út, Trương Quốc Phú và Nguyễn Hữu Hiệp,2011. Ảnh hưởng của vi khuẩn hữu ích lên các yếu tố môi trường và tôm sú (penaeus monodon) nuôi trong bể. Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ 20b: 59-68
Tô Hoàng Diễm. 2013. Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui trồng ở Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên ngành Vi sinh vật học. Viện nghiên