b) Thu hoạch và nhân giống sả
2.3.1 Vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có
khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N.
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như
Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì
cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC (Rosovitz et
al., 1998).
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9-10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius.
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…),
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
a) Bacillus cereus
Đây là loài có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí…
Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Một số loài được áp dụng để sản xuất kháng sinh.
Tế bào Bacillus cereus (B. cereus) dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5) µm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 –1,5) µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm (Nguyễn Lân Dũng, 1983).
Vào năm 2004, theo nghiên cứu Ding et al., gen nifH được phát hiện trong cả hai chi Bacillus và Paenibacillus và được chứng minh là hữu ích cho việc xác định vi khuẩn cố định đạm, báo cáo đầu tiên của chuỗi gen nifH có trong B. cereus và B. megaterium. B. cereus có thể sản xuất siderophores (hiện tượng vi khuẩn tiết ra chất kết tủa các ion sắt có trọng lượng phân tử thấp trong môi trường), IAA và được chứng minh có hoạt tính kháng nấm (Longfei et.al., 2011). B.cereus kết hợp với một nửa tỷ lệ phân bón N được đề nghị trong sản xuất bông, có thể thay thế số lượng N trong phạm vi từ 37,5 – 65 kg/ha) (Cosico et al., 2003).
B. cereus phân lập từ kết mạc cho hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi sinh vật
chỉ thị như Micrococcus luteus, Staphyloccocus aureus, S. epidermidis, S.hominis, S.
lugdunensis, S.warneri, S. haemolyticus, Listeria monocytogenes, và Proteus mirabilis
(Sertaç Argun Kıvanç et.al., 2014). Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Tuyết Ngân
et.al. (2011), các chỉ tiêu môi trường như COD, TAN, TKN, TN trong bùn, TP trong
nước và trong bùn ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn được cải thiện tốt hơn lô đối chứng, vi khuẩn Vibrio sp. bị lấn át ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn. Toyocerin
(probiotic từ bào tử của B. cereus var. toyoi có tác dụng rõ ràng tới hệ thống miễn dịch của động vật dạ dày đơn (monogastrica nimals) là heo và gia cầm thông qua sự tăng cường phát triển của các tế bào miễn dịch và sản xuất kháng thể) làm giảm tỷ lệ nhiễm Salmonella ở heo và gia cầm (Vila et.al., 2009). Trong một nghiên cứu của Wang et.al. (2014), B. cereus chứa một nhóm gen mới mã hóa cerecidins lantibiotic-một lớp
của peptide kháng sinh, có khả năng kháng lại một loạt các vi khuẩn Gram dương như
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis và thậm chí Streptomyces. b) Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand
Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 .Chúng được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô (Nguyễn Lân Dũng, 1983).
Vi khuẩn phân hủy pectin và polysaccaride ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bịu. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính acid ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì.
Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis.
Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 –5) x 0,6 µm. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi. Khuẩn lạc khô, không màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch.
Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36oC –50oC, tối đa khoảng 60oC. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6–0,9µm. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200-300 năm (Nguyễn Thành Đạt, 1990).
Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV). Đặc biệt,
B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật –một thực phẩm chức năng rất
bổ dưỡng cho sức khỏe (Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2007).
c) Bacillus megaterium
Bacillus megaterium là vi khuẩn hình que, Gram dương, có bào tử, thường ở
dạng chuỗi, là một loại vi khuẩn hoại sinh thường có trong đất, một số dòng được chứng minh có khả năng cố định đạm, B. megaterium đã được công nhận như là một endophyte và là một tác nhân tiềm năng cho việc kiểm soát sinh học của các bệnh thực vật (De Vos et al., 2009), (Vary et al., 2007.), là một trong những loại vi khuẩn có kích thước lớn nhất được tìm thấy trong đất vì thế được gọi là “mega” (Euzéby, 1997), (Bunk et al., 2010). B.megaterium được coi là vi khuẩn không gây bệnh nhưng chúng
có thể là tác nhân gây nên hiện tượng phân hủy và thối rữa.
Trong công nghệ sinh học nhờ kích thước lớn của vi khuẩn đã cho phép sử dụng
B.megaterium trong các nghiên cứu về protein cũng như các nghiên cứu về màng tế
bào thành công. Chủng đơn được sử dụng cho nhiều nghiên cứu trên nhiều lĩnh vực của sinh lý bào tử và cấu trúc màng tế bào (Bunk et al., 2010). Một số các ứng dụng đó được áp dụng trong xử lý môi trường và công nghiệp như sản xuất các enzyme Glucose dehydrogenase, Penicillin aminidase và đặc biệt là β-amylase hay các Biodegration enzymes, ứng dụng trong sản xuất vitamin B12, Oxetanocin, … và nhiều ứng dụng khác trong công nghệ gen và tái tổ hợp (Vary et al., 2007).
B. megaterium được phát hiện có chứa chuỗi gen nifH có khả năng cố định đạm
(Ding et.al., 2004), hòa tan phosphate mạnh nhất trên đĩa Pikovskaya và môi trường lỏng làm giảm pH môi trường xuống 1,2 đơn vị, vi khuẩn còn giúp cân bằng N và P dinh dưỡng trên cây lúa mì (Hesham, 2005). Vi khuẩn còn có khả năng sản xuất IAA, siderophore, amonium, đối kháng lại Rhizoctonia solani và Fusarium oxysporum, tạo ra enzym thủy phân sản phẩm (protease, chitinase và cellulase), sản xuất 1- aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase, khi chủng vào hạt giống táo trồng trong ống nghiệm cho thấy cây nảy mầm nhanh hơn và phát triển tốt hơn mẫu đối chứng (Kumar et.al., 2014). Phân P kết hợp với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium var.
phosphaticum giúp hấp thu tốt N, P và K ở lá và rễ, cùng với sự tăng trưởng tốt ở cây
dưa leo và ớt cho thấy tiềm năng của vi khuẩn để làm phân bón vi sinh cho cây trồng (Han et al., 2006 ).
Trong nghiên cứu của Belma et al. (2002), B. megaterium có khả năng kháng lại các loại vi khuẩn thử nghiệm như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica và Micrococcus flavus. Ngoài ra, thuốc kháng sinh được sản xuất từ vi khuẩn B. megaterium có khả năng kháng với vi khuẩn Staphylococcus aureus (kháng
với thuốc kháng sinh methicillin), Leuconostoc mesenteroides (kháng với thuốc kháng sinh glycopeptide), Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli (Malanicheva et al., 2012).
2.3.2 Azospirillum.
Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn và đã được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau. Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới và được gọi là Azospirillum (Tarrand et al., 1978).
Azospirillum là những vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hay hơi cong, kích thước tế bào biến thiên trong khoảng từ 0,6-1,7 x 2,1 – 3,8 µm và có khả năng chuyển động (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005). Sự tăng sinh Azospirillum xảy ra dưới cả hai điều kiện hiếu khí và kỵ khí, nhưng thích hợp hơn là điều kiện vi hiếu khí với sự hiện diện hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường (Dobereiner và Pedrosa, 1987).
Ở Mỹ, từ 1974-1976 những thí nghiệm cho thấy việc chủng Azospirillum có thể thay thế 40kg đạm/ha/năm (Smith et.al, 1978). Các nhà nghiên cứu cho rằng việc gia tăng sản lượng nhờ Azospirillum có thể do sự tăng sinh rễ nhanh hơn là sự cố định đạm sinh học (Tien et al., 1979; Smith et al., 1984). Các nghiên cứu của Hiệp et al. (2005) cho thấy khi sử dụng vi khuẩn Azospirillum lipoferum chủng cho cây bắp giúp rễ bắp dài hơn cây đối chứng không chủng vi khuẩn nhờ đó cây bắp có chủng có thể hấp thụ dưỡng chất trong đất tốt hơn đồng thời có khả năng kháng hạn tốt hơn.
2.3.3 Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn thuộc nhóm γ–proteobacteria, vi khuẩn Gram âm, hình que, không hay ít di chuyển sống kỵ khí không bắt buộc có hai loài quan trọng đó là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca. Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên
trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống tự nhiên trong cây. Vi khuẩn này được phân lập và nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA trên vùng rễ nhiều loài thực vật
như mía (Govindarajan et al., 2007), đậu nành (Kuklinsky et al., 2004). Do có khả
năng tổng hợp IAA nên vi khuẩn Klebsiella giúp tăng chiều dài rễ và chồi thực vật
(Sachev et al., 2009).
2.3.4 Vi khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng
dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài
Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh
học.
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lý là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen.
Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và
phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae (Glickmann et al., 1998; Suzuki et al., 2003; Xie
et al., 1996). Chúng có khả năng hòa tan phosphat. Trong rác ủ, phospho tồn tại ở nhiều dạng hợp chất khác nhau. Phospho được tích lũy trong rác khi động thực vật chết đi, những hợp chất phospho hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành các hợp chất phospho vô cơ khó tan. Do đó phospho tồn tại ở hai dạng: phospho hữu cơ và phospho vô cơ. Vi sinh vật hòa tan lân hữu cơ chủ yếu thuộc hai chi: Bacillus và Pseudomonas. Các loài có khả năng hòa tan mạnh là B. megatherium, B. mycoides và Pseudomonas sp.
Trong số các loài Pseudomonas spp., P. fluorescens là được chú ý nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004).
Pseudomonas fluorescens:
Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram âm, có đơn hoặc tùng mao,
sống hiếu khí bắt buộc nhưng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào. Chúng có cơ chế trao
đổi chất cực kỳ linh hoạt giúp chúng sống được cả trong đất và trong nước. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25-30oC.
Đến nay, người ta vẫn chưa biết được chính xác cơ chế kiểm soát sinh học của
Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết được đưa ra như sau: thứ nhất người ta
cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh thực sự. Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ như tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe. Cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi sinh vật khác, chẳng hạn như các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen cyanide.
Theo Sivamani et al., (1987) vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể được
dùng như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum gây
bệnh héo moko và vi khuẩn Xanthomonas campestris.
2.3.5 Vi khuẩn Azotobacter
Năm 1966, Döbereiner phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ
đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra vi khuẩn Azotobacter paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh.
Vi khuẩn Azotobacter hình que, hiếu khí, di động nhờ chiên mao. Giống này có tính mẫn cảm với độ pH, nồng độ phosphat cao và với nhiệt độ trên 350C. Các tế bào Azotobacter già gồm các thể bào xác (encysted forms) có hình thái rõ rệt. Các bào xác có đặc tính hơi chống chịu lại với các điều kiện khó khăn của môi trường như nhiệt độ, sự khô khan (Sadoff, 1975).
Đây là loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên, khi Brown (1976) theo dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspanum notatum cũng được cộng sinh với sự có mặt của Azotobacter paspali ở vùng rễ. Bà cho rằng Azotobacter paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspanum notatum chủ yếu bằng việc