c) Phương pháp
3.2.8 Nhận diện các dòng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn cao để thực hiện kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.
Quy trình trích DNA nhanh (Barberio et al., 1994)
Cấy vi khuẩn từ ống trữ ròng lên đĩa Petri chứa môi trường PDA. Ủ 1 - 2 ngày trong tủ ủ ở 30o C. Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf có chứa 20 μl nước cất hai lần.
Đun cách thủy các tuýp ở 95oC trong 10 phút. Sau đó làm lạnh các tuýp trong nước đá xay nhuyễn thời gian 10 phút để phá vỡ tế bào vi khuẩn.
Ly tâm nhẹ hai lần, thu được dịch trích DNA của vi khuẩn.
Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
Bƣớc 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự
sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bƣớc 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi (primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn bắt cặp (annealing).
Bƣớc 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
Chu kỳ trong phản ứng PCR
95oC (Biến tính) 5 phút 95oC (Biến tính) 70 giây
53oC (Gắn mồi) 30 giây lặp lại 30 chu kỳ 72oC (Kéo dài) 90 giây
72oC (Kéo dài) 5 phút
Các sản phẩm sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng PCR được trữ ở 4oC và sẽ tiếp tục được phân tích bằng diện di trên gel agarose 1,2%.
Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây sả, phản ứng PCR gen 16S-rDNA (Lane, 1991) sử dụng đoạn mồi:
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine.
Điện di gel chứa sản phẩm PCR
Chuẩn bị gel agarose 1% với thể tích 40 ml. Cân 0,4 g agarose cho vào chai nắp xanh. Đong 40 ml dung dịch TE 1X cho vào chai và lắc nhẹ cho agarose tan đều. Đặt chai vào lò vi sóng, đun khoảng 5 phút để cho agarose tan hoàn toàn và tạo thành dung dịch trong suốt. Lấy chai ra để nguội khoảng 55o - 60oC rồi bổ sung 0,8 μl Ethium
27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ 1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’
bromide, lắc nhẹ đều. Rót dung dịch vào góc dưới của khuôn gel đã được chuẩn bị, tránh tạo bọt khí. Để khoảng 45 phút cho gel nguội và đặc lại rồi lấy lược ra khỏi khuôn.
Load mẫu: Dùng Micropipet hút 10µL Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10µL mẫu DNA vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng.
Đặt khuôn gel vào bể điện di dung dịch TE buffer 1X cho ngập gel. Load các mẫu sản phẩm PCR vào mỗi giếng với thể tích 10 μl bao gồm 8 μl mẫu trộn với 2 μl loading buffer. Sau cùng, load 4 μl DNA thang chuẩn 100 bp vào giếng. Mở nguồn điện, cài đặt cho thiết bị ở 95 Vol trong 80 - 90 phút. Quan sát thấy chất chỉ thị màu xanh di chuyển gần cuối gel, tắt nguồn điện, lấy khuôn gel ra để chụp hình. Chụp hình gel đã điện di sản phẩm PCR.
Sau khi điện di, chụp hình DNA bằng hệ thống máy Bio-Rad Universal Hood II (Mỹ). Nếu các dòng vi khuẩn có band ở vị trí trùng với kích thước và vị trí của đối chứng dương thì đó là dòng vi khuẩn cùng loài với đối chứng dương. Chọn một số dòng vi khuẩn triển vọng nhất để giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Korea.
Trình tự 16S của các dòng vi khuẩn được so sánh với trình tự 16S trên ngân hàng gen bằng chương trình BLAST N để xác định mức độ đồng hình của các dòng vi khuẩn với các trình tự 16S của các dòng vi khuẩn khác.
CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
4.1.1 Phân lập vi khuẩn
Từ rễ, thân và lá của cây Sả được thu thập từ một số huyện (Hòn Đất, Tân Hiệp và Giồng Riềng) trên địa bàn tỉnh Kiên Giang, 19 dòng vi khuẩn đã được phân lập. Các dòng vi khuẩn phân lập ròng, được đặt tên là Hx (trong đó H là ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập được và x là số thứ tự dòng từ 01 đến 19). Các dòng vi khuẩn này phân bố ở cả trong rễ, thân và lá Sả. Chúng có chung đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Khi được cấy trong môi trường bán đặc, vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle (màu trắng trên môi trường NFb), cách bề mặt môi trường 3-6 mm sau 2-3 ngày nuôi (Hình 6).
Vòng Pellicle
Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn được liệt kê trong bảng 6.
Bảng 6: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng PDA
STT
Dòng vi khuẩn
Vị trí phân
lập Địa điểm thu mẫu
1 H01 Lá Thị trấn Tân Hiệp – Tân Hiệp – Kiên Giang 2 H02 Thân Xã Thạnh Hưng – Giồng Riềng – Kiên Giang 3 H03 Thân Thị trấn Tân Hiệp – Tân Hiệp – Kiên Giang 4 H04 Thân Xã Mỹ Thuận – Hòn Đất – Kiên Giang 5 H05 Thân Xã Mỹ Thuận – Hòn Đất – Kiên Giang 6 H06 Thân Xã Thạnh Hưng – Giồng Riềng – Kiên Giang 7 H07 Rễ Thị trấn Tân Hiệp – Tân Hiệp – Kiên Giang 8 H08 Rễ Xã Mỹ Thuận – Hòn Đất – Kiên Giang 9 H09 Lá Xã Mỹ Thuận – Hòn Đất – Kiên Giang 10 H10 Rễ Xã Mỹ Thuận – Hòn Đất – Kiên Giang 11 H11 Lá Xã Thạnh Hưng – Giồng Riềng – Kiên Giang 12 H12 Thân Thị trấn Tân Hiệp – Tân Hiệp – Kiên Giang 13 H13 Rễ Xã Thạnh Hưng – Giồng Riềng – Kiên Giang 14 H14 Thân Xã Mỹ Thuận – Hòn Đất – Kiên Giang 15 H15 Lá Xã Mỹ Thuận – Hòn Đất – Kiên Giang 16 H16 Lá Xã Thạnh Hưng – Giồng Riềng – Kiên Giang 17 H17 Lá Xã Thạnh Hưng – Giồng Riềng – Kiên Giang 18 H18 Rễ Xã Thạnh Hưng – Giồng Riềng – Kiên Giang 19 H19 Lá Xã Thạnh Hưng – Giồng Riềng – Kiên Giang
4.1.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được
Cấy các dòng vi khuẩn đã ròng lên môi trường PDA trong đĩa petri, ủ ở 30oC. Kết quả quan sát cho thấy đa số các dòng vi khuẩn phân lập có khuẩn lạc tròn 13/19 dòng (chiếm 68,42%), dạng không đều có 6/19 dòng (chiếm 31,58%). Hầu hết có màu trắng đục 14/19 dòng (chiếm 73,68%), 2 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng trong và 2 dòng màu vàng đậm (mỗi dòng chiếm 10,53%) và chỉ có 1 dòng có khuẩn lạc màu vàng nhạt (chiếm 5,26%) (bảng 7). Kích thước khuẩn lạc của vi khuẩn sau 24 giờ cấy trên môi trường PDA và ủ ở 30oC dao động từ 1-6 mm (Hình 7).
Hình 7: Khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng PDA.
Ghi chú: Dòng H01: Màu trắng đục, hình tròn, bìa nguyên, độ nổi mô Dòng H13: Màu vàng nhạt, hình tròn, bìa nguyên, độ nổi mô Dòng H16: Màu trắng đục, không đều, bìa răng cưa, độ nổi lài
Bảng 7. Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng PDA sau 24 giờ STT Dòng vi khuẩn Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng khuẩn lạc Đƣờng kính (mm)
1 H01 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 3,5
2 H02 Trắng trong Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 3
3 H03 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 2
4 H04 Vàng đậm Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 2
5 H05 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 1,5
6 H06 Trắng trong Không đều, bìa răng cưa, độ nổi lài 1,5
7 H07 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 1
8 H08 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 1,5
9 H09 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 2,5
10 H10 Vàng đậm Không đều, bìa răng cưa, độ nổi lài 1,5
11 H11 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 3,5
12 H12 Trắng đục Tròn, bìa răng cưa, độ nổi lài 2
13 H13 Vàng nhạt Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 1
14 H14 Trắng đục Không đều, bìa răng cưa, độ nổi mô 6
15 H15 Trắng đục Không đều, bìa răng cưa, độ nổi mô 3
16 H16 Trắng đục Không đều, bìa răng cưa, độ nổi lài 2
17 H17 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 4
18 H18 Trắng đục Không đều, bìa răng cưa, độ nổi lài 1,5
19 H19 Trắng đục Tròn, bìa răng cưa, độ nổi lài 1
Dạng bìa khuẩn lạc: Đa số có dạng tròn 13/19 dòng (chiếm 68,42%), dạng không đều 6/19 dòng (chiếm 31,58%).
4.1.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn trên môi trường PDA
Bảng 8 cho thấy đa số các dòng vi khuẩn phân lập được có dạng hình que và một số hình cầu. Trong đó vi khuẩn hình que ngắn (10/19) chiếm 52,63%, que dài (7/19) chiếm 36,84% và hình cầu (2/19) chiếm 10,53%. Đa số các dòng vi khuẩn chuyển động (13/19) chiếm 68,42%. Kích thước tế bào dao động từ 1,71- 4,29 x 0,86-2,57 µm phù hợp với tế bào vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá của Phạm Thanh Sang (2014). Kết quả nhuộm Gram cho thấy đa số các dòng vi khuẩn phân lập được là Gram âm (17/19) chiếm 89,47% (Hình 8).
Bảng 8. Đặc tính vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng PDA
STT Dòng Grama Chuyển độngb Hình dạng vi khuẩn Kích thƣớc vi khuẩn
vi khuẩn Chiều dài
(µm) Chiều rộng (µm) 1 H01 - + Que ngắn 2,57 1,71 2 H02 - - Que ngắn 2,57 1,71 3 H03 - + Que dài 3,43 1,71 4 H04 - + Que ngắn 2,57 0,86 5 H05 - + Que ngắn 1,71 0,86 H19
Hình 8: Vi khuẩn Gram âm (H19) và Gram dƣơng (H16) Độ phóng đại vật kính X100
6 H06 - - Que ngắn 1,71 0,86 7 H07 - + Que dài 3,43 1,71 8 H08 - + Que ngắn 1,71 0,86 9 H09 - - Cầu 2,57 2,57 10 H10 - + Que ngắn 1,71 0,86 11 H11 - + Que dài 3,43 0,86 12 H12 - - Cầu 2,57 2,57 13 H13 + - Que dài 3,86 1,71 14 H14 - + Que dài 3,43 1,71 15 H15 - + Que ngắn 1,71 0,86 16 H16 + - Que dài 3,43 0,86 17 H17 - + Que ngắn 1,71 0,86 18 H18 - + Que ngắn 2,57 0,86 19 H19 - + Que dài 4,29 0,86
Ghi chú: a: (–) gram âm, (+) gram dương. b: (–) không chuyển động, (+) chuyển động
4.2 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn
Trong số 19 dòng vi khuẩn phân lập được sau khi khảo sát khả năng hòa tan lân trong môi trường NBRIP đặc , kết quả chỉ có 14 dòng vi khuẩn tạo được vòng halo (hình 9) chứng tỏ các dòng vi khuẩn này có khả năng hòa tan lân khó tan (bảng 9). Các dòng vi khuẩn này còn có khả năng thay đổi màu môi trường (từ xanh sang vàng) do hạ pH (môi trường có chất chỉ thị màu bromothymol blue) do các dòng vi khuẩn sinh trưởng tổng hợp được acid hữu cơ (Rossosilini et al., 1998) (Hình 9).
Ngày 2 sau khi chủng, có 10 dòng tạo vòng halo, dòng có khả năng hòa tan lân mạnh nhất là H06 (E=241,67) và H12 (E=243,33), khác biệt có ý nghĩa so với các dòng có hệ số hòa tan lân thấp là H02, H04, H08, H10 và H13 nhưng lại khác biệt không ý nghĩa với các dòng H09 và H17.
Đến ngày 4, có thêm dòng H01, H03, H15 và H16 tạo vòng halo. Dòng có hiệu suất hòa tan lân cao nhất là H18 (E=260,00) khác biệt không ý nghĩa với các dòng H12 và H13 nhưng khác biệt có ý nghĩa với các dòng còn lại. Dòng hòa tan lân thấp nhất là H15 (E=141,03).
Đường kính halo của các dòng tiếp tục tăng vào ngày 6 nhưng chậm hơn so với ngày 4 (Bảng 10). Dòng hòa tan lân mạnh nhất vẫn là dòng H18 (E=260,00) và thấp nhất là dòng H15 (E=122,13). Dòng H15 hòa tan lân thấp và chỉ tăng kích thước đường kính khuẩn lạc mà không tăng đường kính halo, chứng tỏ dòng vi khuẩn này có thể đã sử dụng lượng lân hòa tan để phát triển sinh khối (Ohtake et al., 1998).
Trong số 14/19 dòng có khả năng hòa tan lân, dòng H18 có hiệu suất hòa tan lân cao nhất vào ngày 6 (E=260,00). Theo nghiên cứu của Tô Hoàng Diễm (2013), dòng vi khuẩn L5 nội sinh trong cây cúc mui có E=220,8 vào ngày thứ 5. Nghiên cứu khác của Phạm Thanh Sang (2014), 2 dòng RS5 và LS3 nội sinh trong cây diếp cá có hiệu quả hòa tan lân lần lượt là 186,9% và 183,3%. Điều này cho thấy dòng H18 có triển vọng để ứng dụng vào sản xuất phân vi sinh bón cho cây dược liệu.
Hình 9: Vòng halo do vi khuẩn hòa tan lân tạo ra
Ghi chú: LP1I là dòng H15 R2III là dòng H13
Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn được thể hiện trong bảng 9.
Bảng 9. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn
STT Dòng
Thời gian ủ
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
E E E 1 H01 0,00 163,74cd 132,60fg 2 H02 156,67c 193,33bc 188,89bcd 3 H03 0,00 153,77d 169,05cdef 4 H04 173,33c 198,89bc 174,60cdef 5 H06 241,67a 212,22b 195,56bcd 6 H08 157,78c 165,56cd 153,17defg 7 H09 225,56ab 176,19bcd 190,48bcd 8 H10 168,89c 210,48b 180,48cde 9 H12 243,33a 255,00a 226,67ab 10 H13 178,52c 258,89a 172,76cdef 11 H15 0,00 141,03d 122,13g 12 H16 0,00 167,46cd 140,00fg 13 H17 201,11abc 206,67b 203,61bc 14 H18 186,67bc 260,00a 260,00a CV(%) 13,67 11,48 14,37
Ghi chú: E là hệ số hòa tan lân
Các trị trung bình theo sau các mẫu tự giống nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở 5%
4.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn
Mười chín dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường PDA được chọn khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ từ nitơ tự do sau 2, 4 và 6 ngày (sau khi chủng trong môi trường NFb lỏng, không N, không Yeast extract). Sau hai ngày chủng vi khuẩn, cả 19 dòng đều có khả năng tổng hợp đạm tùy theo dòng và có xu hướng giảm dần từ ngày 2
đến ngày 6. Đây là xu hướng chung của hầu hết các dòng vi khuẩn vì sau khi chủng, các dòng vi khuẩn chưa kịp thích ứng với môi trường nên khả năng tạo nên hàm lượng đạm thấp, đến ngày thứ 4 sau khi đã bắt đầu quen với môi trường, chúng sinh trưởng và phát triển mạnh nên khả năng tổng hợp đạm cao hơn. Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, khi đã phát triển ở mức tối đa, mật số vi khuẩn ngày càng tăng nhưng chất dinh dưỡng trong môi trường để sử dụng có giới hạn nên các dòng vi khuẩn đã sử dụng lượng đạm mà chúng đã tổng hợp làm hàm lượng đạm giảm đi đáng kể.
Hàm lượng NH4+ do các dòng vi khuẩn cố định được trình bày ở bảng 10.
Bảng 10. Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn
STT Dòng vi khuẩn
Hàm lƣợng NH4+
trung bình (µg/mL)
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
1 H01 0,17b 0,07cd 0,06e 2 H02 0,17b 0,05d 0,10bcde 3 H03 0,17b 0,10bcd 0,09cde 4 H04 0,20b 0,05d 0,15abcd 5 H05 0,16b 0,19ab 0,21a 6 H06 0,17b 0,05d 0,17abc 7 H07 0,17b 0,20ab 0,11bcde 8 H08 0,18b 0,23a 0,07de 9 H09 0,22b 0,19ab 0,12bcde 10 H10 0,18b 0,17ab 0,18ab 11 H11 0,22b 0,18ab 0,04e 12 H12 0,28b 0,19ab 0,05e 13 H13 0,19b 0,14abcd 0,04e 14 H14 0,25b 0,14abcd 0,05e 15 H15 0,54a 0,13abcd 0,06e
16 H16 0,30b 0,13abcd 0,09cde 17 H17 0,17b 0,14abcd 0,07de
18 H18 0,19b 0,18ab 0,06e
19 H19 0,19b 0,15abc 0,10bcde
CV(%) 44,21 43,97 53,26
Ghi chú: Các trị trung bình theo sau các mẫu tự giống nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở 5%
Sau khi chủng 2 ngày, 19 dòng vi khuẩn ở rễ, thân , lá đều có khả năng tổng hợp đạm. Dòng tổng hợp cao nhất là H15 (0,54 µg/mL) khác biệt có ý nghĩa với các dòng khác, dòng vi khuẩn này thích ứng với môi trường nhanh nên sinh trưởng, phát triển và