- Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo và Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Phân lập vi khuẩn lên men lactic:
4.5. Kết quả kiểm tra khả năng chịu acid và muối mậ t:
Khả năng chịu được acid hay muối mật cũng là một trong những đặc tính cần có của 1 chủng được xem là có hoạt tính probiotic , vì nó giúp cho vi khuẩn có thể tồn tại và sống được trong môi trường pH thấp và có sự hiện diện của muối mật, nhờ vậy vi khuẩn sống sót được khi qua hệ tiêu hóa của người như dạ dày để đi đến ruột và sau đó phát triển mang lại những lợi ích nhất định chủ yếu là tại vùng ruột.
10 chủng được xem là có hoạt tính probiotic cần phải được tiếp tục kiểm tra. Nhưng trong điều kiện thí nghiệm cho phép, chỉ kiểm tra khả năng chịu acid, muối mật của 2 chủng nổi bật nhất là Na8, E2 và một chủng được đề xuất là Lactobacillus casei
Shirota (do phân lập từ sản phẩm sữa chua men sống Yakult và chỉ cho 1 chủng vi khuẩn duy nhất) do thời gian có hạn và mục tiêu của đề tài là chỉ xác định chủng có hoạt tính pobiotic nên ở bước kiểm tra này chỉ mang tính định tính, thể hiện ở phần trăm sinh khối vi khuẩn chịu được acid và muối mật của vi khuẩn trong ống thí nghiệm khi so với ống đối chứng, từ đó ta suy ra được chủng vi khuẩn kiểm tra có khả năng chịu acid, muối mật hay không và khả năng đó mạnh hay yếu.
Để kiểm tra khả năng chịu acid vi khuẩn được cấy vào các môi trường MRS broth có giá trị pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và kiểm tra tính chịu muối mật với nồng độ muối mật trong môi trường MRS broth là 0.3% vì ở nồng độ này sự phát triển của vi khuẩn đã bị ức chế nhưng mỗi chủng có khả năng chịu đựng khác nhau và giá trị này cũng gần
SVTH: Dương Thúy Vy 102
với nồng độ muối mật trong hệ tiêu hóa. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần với 2 ống nghiệm, mang ủ 24 giờ, sau đó tiến hành đo mật độ sinh khối như đã nêu ở mục 3.2.2.6,
lấy giá trị OD trung bình của 2 ống thí nghiệm và so sánh với OD đo được của ống đối chứng để đưa ra đánh giá.
Ống đối chứng là ống có nuôi cấy chủng vi khuẩn trong MRS broth có pH=7 và không chứa muối mật, được dùng làm đối chứng cho cả 1 thí nghiệm kiểm tra chịu acid và chịu muối mật
Thông thường trong các nghiên cứu về khả năng chịu acid và muối mật của chủng probiotic, người ta tiến hành cấy một lượng vi khuẩn nhất định vào các ống thí nghiệm chứa môi trường MRS broth có pH và nồng độ muối mật cần khảo sát, sau đó ủ từ 15 phút đến 3 giờ, vì đây là thời gian thức ăn được tiêu hóa bên trong dạ dày và một phần ruột non, khi probiotic cùng thức ăn đi vào cở thể do hoạt động tiêu hóa nên tại đây sẽ sinh ra nhiều acid và muối mật. Sau khoảng thời gian trên, môi trường thử nghiệm có chứa vi khuẩn sẽ được mang cấy trãi trên MRS agar, ủ 24 giờ sau đó đếm số khuẩn lạc đã phát triển (cfu/ml) và so sánh với lượng khuẩn lạc có ban đầu để suy ra tỷ lệ sống sót cũng như khả năng chịu acid và mật của chúng. Nhưng trong thí nghiệm ở đây, thời gian ủ vi khuẩn trong môi trường thí nghiệm có pH thấp và muối mật 0.3% là 24 giờ nên không thể kết luận được chính xác lượng vi khuẩn sống sót khi chúng ở trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên sau thời gian ủ 24 giờ cả 3 chủng thí nghiệm vẫn thể hiện khả năng sống sót và tiếp tục phát triển (được thể hiện cụ thể hơn ở mục 4.1.1.1 và