Hình 2.9: Các hướng an toàn của probiotics (Maria. 2000).
2.3.3. Phương pháp tìm kiếm các nguồn probiotics mới.
Hiện nay trên thị trường có nhiều sản phẩm probiotics dùng trong dược phẩm, chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm đều giống nhau về thành phần vi sinh, chỉ khác nhau về nhà sản xuất, mà mỗi chủng lại có phổ tác dụng khác nhau. Vì vậy việc phân lập để tuyển chọn ra những chủng, giống mới sẽ góp phần làm phong phú thêm nguồn probiotics, làm tăng khả năng phòng và trị bệnh cho người và động vật. Viêc lựa chọn và phân lập các chủng vi khuẩn sản xuất probiotics là một quy trình lựa chọn cẩn thận.
Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của vi khuẩn lactic đã trở nên được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các chủng vi khuẩn lactic
SVTH: Dương Thúy Vy 42
thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúp kích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên, đồng thời vì chúng có nguồn gốc từ thực phẩm nên đa số là đảm bảo về mặt an toàn cho con người và vật nuôi.
Vì vậy vi khuẩn lactic thường được chọn để trở thành probiotics.
Vi khuẩn lactic được phân lập trên môi trường chuyên biệt MRS (DeMan, Rogosa, Sharpe.1960) từ nhiều nguồn khác nhau:
- Từ các sản phẩn thực phẩm lên men như: kefir, sữa chua, dưa chua, nem chua, kim chi….
- Từ phân của các gia cầm: thỏ, gà, heo và từ mề gà… - Từ sữa mẹ, phân trẻ sơ sinh….
Một chủng vi khuẩn sau khi đã được tuyển chọn, tạo dòng thuần thì việc quan trọng kế tiếp là phải xác định chúng thuộc giống nào, loài nào. Vì vậy, các phương pháp định danh được áp dụng.
Công việc tuyển chọn ngoài việc tìm ra chủng đảm bảo những thuộc tính đặc biệt của probiotics, đảm bảo sự ổn định và độ thuần khiết cao và từ đó lự chon chủng có hoạt lực cao nhất theo từng mục đích sử dụng, từng đối tượng cho phù hợp.
Khảo sát tính an toàn của chủng (đối với con người, cho động vật và môi trường) trước khi mang đi sử dụng.
2.3.4. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập
2.3.4.1. Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển. (Owen R. Fennema et al. 2004) et al. 2004)
Ban đầu “vi khuẩn lactic” được dùng để chỉ các vi khuẩn làm chua sữa và sau đó một dạng vi khuẩn thuần khiết cũng được cho là vi khuẩn lactic ( có thể là Lactococcus lactis) được đưa ra bởi J. Lister vào năm 1873. Một bước quan trọng trong phân loại vi
khuẩn lactic được hình thành khi có sự giống nhau giữa các vi khuẩn trong sữa chua và các vi khuẩn tạo acid lactic khác có trong các nguồn khác nhau. Tuy nhiên vẫn còn
SVTH: Dương Thúy Vy 43
nhiều nhầm lẫn khi chuyên khảo của Orla- Jensen xuất hiện (Orla-Jensen. 1919) và nó có ảnh hưởng lớn đến hệ thống phân loại của LAB, mặc dù đã có sự sửa đổi dáng kể nhưng cơ sở cho việc phân loại vẫn không thay đổi, Orla-Jensen vẫn phân loại dựa trên phương pháp cổ điển như : so sánh hình thái vi khuẩn (cocci, rod hoặc dạng tetrad), hình thức lên men glucose ( đồng hình, dị hình), khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau (10oC và 45oC), khả năng lên men các nguồn đường khác nhau. Năm 1985 có thêm nhiều giống LAB mới được mô tả, tuy nhiên việc phân tích theo phương pháp cổ điển dựa vào hình thái vi khuẩn vẫn giữ vai trò quan trọng trong phân loại LAB.
Các giống LAB cũng đã được mô tả lại trong Bergey’s manual 1986, đây được xem như là phiên bản cuối cùng và chủ yếu tiếp tục phản ánh kết quả của Orla-Jensen 1919. Trong đó có sự phù hợp với các mô tả chung của các giống LAB điển hình: Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Sự thay đổi chính trong Bergey’s manual 1986 là giống Streptococcus lần đầu tiên được chia thành 3 nhóm : Enterococcus, Lactococcus và Streptococcus sensu stricto (Schleifer. 1987). Một vài giống LAB giống với Lactococci được đề nghị xếp vào giống Vagococcus, các giống Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus không có thay đổi nhiều, tuy nhiên một vài loài trong Lactobacills được xếp vào giống Carnobacterium, và loài Pediococcus halophilus được đưa lên cấp giống là Tetragenococcus, một số LAB lên men dị hình trong Lactobacillus và Leuconostoc được xếp vào giống Weissella, ngoài ra một số giống mới cũng được mô tả có liên quan nhiều đến LAB như Alloiococcus, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcococcus, Ignavigranum và Lactosphaera…Bản sửa đổi được thực hiện vào năm 1986 cũng đã hỗ trợ nhiều trong việc phân loại vi sinh vật dựa trên thành phần hóa học và di truyền.
2.3.4.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R. Fennema et al. 2004)
Như đã đề cập, cơ sở chung cho việc phân loại LAB vào các giống khác nhau chủ bằng phương pháp định danh cổ điển và so sánh với khóa phân loại của Bergey’s manual1986, tuy nhiên việc này ngày càng gặp khó khăn để đạt kết quả tin cậy khi phân
SVTH: Dương Thúy Vy 44
loại một số giống mới nhưng nó lại là bước quan trọng trước khi tiến hành các phân tích sâu hơn.
LAB được phân chia theo hình thái như sau : dạng trực khuẩn (rod) gồm Lactobacillus và Carnobacterium; dạng cầu khuẩn gồm tất cả các giống còn lại và một ngoại lệ là đối với giống Weissella được mô tả gồm cả dạng trực khuẩn và cầu khuẩn; thêm vào đó, sự phân chia tế bào theo hai hướng vuông góc trên cùng một mặt phẳng dẫn đến sự hình thành dạng tứ cầu khuẩn (tetrad) và nó cũng được sử dụng để mô tả một dạng khác của cầu khuẩn, bao gồm các giống Aerococcus, Pediococcus và Tetragenococcus.
Phân chia theo hình thức lên men glucose, LAB được chia vào 2 nhóm: lên men đồng hình chuyển hóa glucose chủ yếu thành acid lactic và lên men dị hình tạo acid lactic, ethanol, acid acetic và CO2. trong thực nghiệm, kiểm tra sự sinh khí CO2 để phân biệt giữa 2 nhóm (Sharpe. 1979). Leuconostoc, Oenococci, Weissella và phân nhóm của Lactobacilli là lên men dị hình, tất cả các LAB khác là lên men đồng hình.
Sự phát triển ở các nhiệt độ khác nhau cũng gióp phần phân biệt một số giống thuộc cầu khuẩn: Enterococci phát triển ở 10oC và 45oC, Lactococci và Vagococci phát triển được ở 10oC nhưng không thể sống ở 45oC, Streptococci thường không phát triển ở 10oC trong khi lại có thể phát triển ở 45o
C tùy vào loài. Sự chịu muối (6,5% NaCl) cũng được sử dụng để phân biệt giữa Enterococci và Lactococc; Vagococci và Streptococci (Mundt. 1986). Đặc biệt khả năng chịu muối (18% NaCl) được giới hạn trong Tetragenococcus. Khả năng chịu acid ơ kiềm cũng rất hữu ích trong việc phân loại. Aerococci, Carnobacteria, Enterococci, Tetragenococci và Vagococcicos thể phát triển ở pH cao những không phát triển ở pH=9.6.
Ngoài ra sự hình thành các dạng đồng phân của acid lactic trong quá trình len men glucose cũng được sử dụng trong phân biệt giữa Leuconostocs (chỉ tạo D-lactic acid) và Lactobacilli lên men dị hình (tạo acid lactic cả 2 dạng D và L). Tuy nhiên Weissella có thể gây nhầm lẫn trong vấn đề này.
SVTH: Dương Thúy Vy 45