- Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo và Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Phân lập vi khuẩn lên men lactic:
4.4. Kiểm tra khả năng kháng E.coli và Salmonella bằng phương pháp đo độ đục.
Với mục tiêu cuối cùng là tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic nên các chủng đã phân lập được cần phải được tiếp tục sàng lọc bằng việc kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật để tìm ra chủng có thể có hoạt tính probiotic.
SVTH: Dương Thúy Vy 93
Ngày nay người ta quan tâm nhiều hơn đến khả năng kháng các vi khuẩn Gram âm của probiotic vì chúng thường là những vi khuẩn có hại. Và theo mục 2.2.5 các vi khuẩn lactic đã được nghiên cứu ngoài khả năng kháng đối với vi khuẩn Gram dương chúng còn có khả năng kháng đối với một số vi khuẩn Gram âm khác. Vì điều kiện và thời gian thực hiện đề tài có hạn nên việc chọn vi khuẩn làm chỉ thị cho kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của 23 chủng vi khuẩn lactic là 2 chủng E. coli và Salmonella, chúng là những vi khuẩn Gram âm và tác nhân gây nhiễm vi sinh thực phẩm, gây bệnh cho người và động vật thông qua đường tiêu hóa, chúng đồng thời cũng là vi khuẩn có hại trong đường ruột, mà probiotic lại là những vi khuẩn mang lại lợi ích cho hệ tiêu hóa, như vậy một chủng có khả năng trở thành vi khuẩn probiotic có nghĩa là nó phải có khả năng ức chế tăng trưởng đối với E. coli và Salmonella.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lactic như spot on lawn assay, disc diffusion assay, well diffusion assay hoặc phương pháp đo độ đục (turbidimetric method). Phương pháp cuối cùng đơn giản, độ nhạy cao, mang tính định tính và cả định lượng, nên được sử dụng để sàng lọc 23 chủng vi khuẩn lactic đã phân lập nhằm xác định khả năng kháng vi sinh vật của chúng. Phương pháp này chủ yếu khảo sát sự ảnh hưởng của các chất trong quá trình trao đổi chất như các bacteriocin, acid hữu cơ, H2O2… của chủng vi khuẩn với vi sinh vật chỉ thị. Trong phần này phương pháp đo độ đục được sử dụng, tương tự như trong đề tài phân lập của khóa 2005 đã thực hiện nhưng được bổ sung thêm bằng việc kết hợp với thí nghiệm kiểm tra khả năng sinh H2O2 và kiểm tra tính kháng trên cả dịch nuôi cấy LAB ly tâm sau khi được trung hòa để đánh giá cụ thể hơn về khả năng kháng khuẩn của các sản phẩm riêng biệt trong quá trình trao đổi chất và đồng thời cũng mở rộng thêm kiểm tra tính kháng của các chủng phân lập đối với Salmonella
Trong hình 4.16 mẫu thí nghiệm là huyền phù E. coli được ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm đã trung hòa và không trung hòa; còn ở mẫu đối chứng thì thay dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm bằng môi trường MRS cùng thể tích. Ở mẫu thí nghiệm trong nghiệm thức 1: không trung hòa dịch nuôi cấy LAB, tăng trưởng của E. coli và
SVTH: Dương Thúy Vy 94
nuôi cấy LAB (ống số 4, 7), khả năng ức chế giảm và khó nhận biết hơn. Để so sánh định lượng mật độ tế bào E. coli và Salmonella sống sót ta sử dụng phương pháp đo độ
hấp thu ánh sáng theo mật độ tế bào ở các ống thí nghiệm và sau đó so sánh với ống đối chứng.
Từ giá trị OD thu được, ta suy ra % vi khuẩn chỉ thị bị ức chế theo công thức trong mục 3.2.2.5. Khi giá trị này càng cao thì chủng vi khuẩn thử nghiệm có hoạt tính kháng khuẩn càng mạnh.
Kết quả đo khả năng kháng khuẩn được thể hiện trong bảng 4.4
4
SVTH: Dương Thúy Vy 95
Hình 4.16: Thí nghiệm ủ E. coli và Salmonella với dịch nuôi cấy LAB ly tâm
(Ống 1: mẫu trắng là môi trường cao thịt- peptone không cấy vi sinh vật;
Ống 2: ống đối chứng E.coli; Ống 3: ống thí nghiệm kháng E. coli nghiệm thức không trung hòa dịch nuôi cấy LAB ly tâm; Ống 4: ống thí nghiệm kháng E.coli nghiệm thức
có trung hòa; Ống 5: ống đối chứng Salmonella; Ống 6: ống thí nghiệm kháng
Salmonella nghiệm thức không trung hòa; Ống 7: ống thí nghiệm kháng Salmonella
nghiệm thức có trung hòa)
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E.coli và Salmonella của 23 chủng vi khuẩn phân lập.
Chủng LAB
% vi khuẩn E. coli bị ức chế % vi khuẩn Salmonella bị ức chế Có trung hòa Không trung hòa Có trung hòa Không trung hòa
Na2 26% 82% 36% 85% Na3 37% 66% 30% 53% Na4 44% 61% 10% 66% Na5 43% 69% 33% 69% Na8 39% 79%(*) 31% 73% (*) 5 6 7
SVTH: Dương Thúy Vy 96 Nb3 48% 69% 24% 44% Nb5 51% 62% 25% 53% Nb8 54% 55% 24% 57% Nb11 40% 80% 32% 67% Y1 34% 95% 5% 97% B1 45% 91% 3% 94% B2 36% 73% 20% 67% P1 40% 84% 9% 86% P2 36% 69% 0% 51% L1 47% 66% 20% 66% L2 50% 74% 23% 81% E1 35% 97% 18% 97% E2 47% 67%(*) 27% 86%(**) E3 23% 64% 15% 96% E4 26% 97% 5% 96% E6 44% 98% 31% 83% E8 51% 95% 17% 93% E10 43% 92% 6% 90%
(*) : chủng có khả năng kháng 100% E.coli, trong thí nghiêm dịch nuôi cấy sau khi li
SVTH: Dương Thúy Vy 97
Đồ thi 4.1: Khả năng ức chế vi khuẩn E.coli của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và sau khi trung hòa
0%10% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% N a 2 N a 3 N a 4 N a 5 N a 8 N b3 N b5 N b8 N b11 Y1 B1 B2 P1 P2 L1 L2 E1 E2 E3 E4 E6 E8 E10
Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập
% v i k h u ẩ n E .c o li b ị ứ c ch ế
Cột bên trái : Nghiệm thức 1 không trung hòa Cột bên phải : Nghiệm thức 2 sau khi trung hòa Từ đồ thị 4.1 cho thấy :
- Trong cùng 1 mẫu kiểm tra, tỷ lệ ức chế sự tăng trưởng E.coli của dịch nuôi cấy LAB ly tâm không trung hòa lớn hơn rất nhiều so với dịch sau khi trung hòa. Nguyên nhân là do khi chưa trung hòa hoạt lực kháng khuẩn của LAB là tổng hợp khả năng kháng của các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất (acid lacitc, bacteriocin, H2O2,…), nhưng sau khi trung hoà tác động kháng khuẩn của lượng acid hữu cơ do LAB sinh ra đã bị loại bỏ và chủ yếu chỉ còn lại là tác động kháng khuẩn của các chất khác, có thể là bacteriocin, v ì theo kết quả mục 4.9 ta đã loại trừ khả năng kháng do H2O2
SVTH: Dương Thúy Vy 98
- Trong các chủng phân lập từ 2 loại nem mang tính địa phương khác nhau, 2 chủng Na5 và Nb5 cùng thuộc giống Lactococcus chúng có hoạt lực kháng khuẩn khác
nhau không đáng kể. Hoạt lực của chủng Na5 khi chưa trung hòa cao hơn nhưng khi trung hòa thì lại thấp hơn hoạt lực của chủng Nb5. Chứng tỏ mặc dù chủng Nb5 sinh ít acid hơn nhưng lại tạo ra các chất khác cũng có tính kháng nhiều hơn, và đạt tỷ lệ kháng trên 50%
- Nhìn chung trong mỗi nguồn phân lập (nem, sữa len men, phân trẻ sơ sinh) đều xuất hiện chủng có khả năng ức chế E.coli rất cao (trên 90%) như chủng B1, Y1, E1,
E4, E6, E8, E10 và thậm chí có khả năng ức chế hoàn toàn (Na8, E2). Tất cả đều thuộc giống Lactobacillus. Tuy nhiên sau khi trung hòa dịch nuôi cấy khả năng kháng giảm
xuống chỉ còn 35-50%. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn này chủ yếu kháng E.coli bằng acid hữu cơ sinh ra.
Riêng đối với chủng Nb8 (nem Tiền Giang), khả năng kháng E.coli trước và sau khi trung hòa là như nhau (55% và 54%) cho nên chủng Nb8 kháng E.coli không phải
chủ yếu do lượng acid hữu cơ tạo thành mà còn do các yếu tố khác, có thể là các bacteriocin, theo kết quả mục 4.9 ta đã loại trừ khả năng kháng do H2O2. Điều này có thể giải thích vì chủng vi khuẩn này sinh ít acid nên sử dụng ít cơ chất cho hoạt động này, phần còn lại được sử dụng để tạo các chất khác, mà trong trường hợp này hợp chất đó có thể kháng được E. coli. Khả năng kháng khuẩn của chủng Nb8 đạt được trên 50%
cũng được xem là rất đáng kể, và đây cũng là chủng có khả năng sinh bacteriocin đối với E.coli cao nhất trong các chủng phân lập được.
SVTH: Dương Thúy Vy 99
Đồ thi 4.2: khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và sau khi trung hòa
0%10% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Na2 Na3 Na4 Na5 Na8 Nb3 Nb5 Nb7 Nb8
Nb10 Nb11
L1 L2 Y1 Y2 B1 B2 B3 P1 P2 E1 E2 E3 E4 E6 E8
E1
0
Các chủng vi khuẩn được phân lập
% v i kh u ẩn S a lm o n e ll a b ị ứ c ch ế
Cột bên trái : Nghiệm thức 1 không trung hòa Cột bên phải : Nghiệm thức 2 sau khi trung hòa Từ đồ thị 4.2 cho thấy:
- Tỷ lệ ức chế sự tăng trưởng Salonella của dịch nuôi cấy LAB ly tâm không
trung hòa vẫn lớn hơn rất nhiều so với dịch sau khi đã trung hòa. Vì vậy, khả năng kháng Salmonella của các chủng vi khuẩn vẫn do hàm lượng acid lactic sinh ra là chủ
yếu.
- Tính kháng Salmonella của các chủng phân lập từ nem Lai Vung (Đồng Tháp)
thể hiện nổi bật hơn các chủng từ nem Tiền Giang với chủng Na2 kháng được 85% và chủng Na8 kháng 100%. Trong khi các chủng từ nem Tiền Giang chỉ đạt mức kháng
Salmonella cao nhất là 67% (Nb11). Khi loại bỏ tác động kháng khuẩn của acid, các
SVTH: Dương Thúy Vy 100
- Trong các chủng phân lập từ sản phẩm sữa lên men, chủng Y1 (từ Yakult) và B1 (từ Beta gel) vẫn cho hoạt lực kháng khuẩn là cao nhất, trên 90%. Tuy nhiên khi trung hòa dịch nuôi cấy, hoạt lực bị giảm đột ngột đến mức rất thấp, dưới 10%, kể cả chủng P1 và P2 (từ Probi,Vinamilk) cũng bị giảm tương tự, thậm chí chủng P2 hoàn toàn mất khả năng kháng khuẩn sau khi trung hòa dịch lên men. Như vậy, sau khi loại bỏ tác dụng của acid lactic và H2O2, các chất kháng khuẩn khác của các chủng này có tác dụng mạnh trên E.coli hơn là trên Salmonella, cũng có thể do chúng không hoặc sinh rất ít bacteriocin đối với Salmonella.
- Các chủng phân lập là từ phân của trẻ sơ sinh cho các chủng kháng khuẩn mạnh là nhiều nhất. 7/8 chủng có tính kháng trên 90% và 1/8 chủng đạt trên 80%. Tuy nhiên tính kháng khuẩn do acid hữu cơ vẫn là chủ yếu nên khi trung hòa dịch nuôi cấy tính kháng khuẩn cũng đã bị giảm đi rất nhiều, thấp nhất là chủng E4 (5%) và cao nhất là chủng E5 (chỉ đạt 42%)
Tóm lại, xét trên tổng thể các chất kháng khuẩn mà vi sinh vật tạo ra và dựa vào phần trăm ức chế E.coli và Salmonella (Đồ thị 4.1 và 4.2) cho ta thấy các chủng vi khuẩn lactic phân lập được rõ ràng là có khả năng kháng lại các vi khuẩn Gram âm
E.coli và Salmonella, nó phù hợp với những nghiên cứu đã nêu trong mục 2.2.5, vì thế ta chọn ra được 10 chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất (trên 90%) là những chủng có hoạt tính probiotic. Đó là các chủng : Na8, Y1, B1, E1, E2, E3, E4, E6, E8, E10. Trong đó có 2 chủng Na8 (nem Lai Vung) và E2 (phân trẻ sơ sinh) là nổi bật nhất, có khả năng ức chế 100% cả 2 vi sinh vật chỉ thị. Điều này giải thích vì sao thực phẩm lên men truyền thống thường có lợi cho sức khỏe nếu được chế biến đúng cách, trong đó có nhiều loại nem được làm từ thịt sống nhưng vẫn không gây ngộ độc, không gây bệnh hay rối loạn tiêu hóa và mặt khác, trong đường ruột của trẻ sơ sinh vẫn tồn tại vi khuẩn có lợi, giúp bảo vệ hệ tiêu hóa và sức khỏe của trẻ, nhất là đối với những trẻ được bú sữa mẹ thì có khả năng miễn dịch cao hơn, ít bị bệnh hơn những trẻ không được bú sữa mẹ trong những giai đoạn đầu. Riêng chủng E3 có khả năng kháng mạnh đối với Salmonella nhưng yếu hơn đối với E.coli (64%) và ngược lại, chủng E6 có khả năng kháng mạnh đối với E.coli nhưng lại yếu hơn đối với Salmonella (83%), tuy
SVTH: Dương Thúy Vy 101
nhiên tính yếu hơn không đáng kể (trên 50%) nên cũng được xem là có hoạt tính probiotic. Như vậy, khả năng kháng của LAB tùy thuộc vào từng chủng và chúng có thể kháng yếu đối với chủng Gram âm này nhưng lại kháng mạnh với chủng Gram âm khác. Ngoài ra, từ 2 đồ thị trên ta cũng xác định được những chủng trong 10 chủng có hoạt tính probiotic có khả năng sinh nhiều các chất khác có thể kháng E.coli ngoài acid hữu cơ và H2O2 là Na8, B1, E2, E6, E8, E10 (~ 40 - 50% ) và đối với Salmonella chỉ có Na8 và E6 có khả năng sinh nhiều các chất kháng khuẩn khác ngoài acid hữu cơ và H2O2 (trên 30%).