- Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo và Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phƣơng pháp luận
Theo tiêu chí an tòan sinh học là trên hết, cho nên đề tài chủ yếu tiến hành phân lập các vi khuẩn lên men lactic (LAB) vì chúng đƣợc xếp vào lọai GRAS (generally recognized as safe).
Để phân lập trƣớc hết cần chọn các nguồn vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống nhƣ nem, các loại sữa chua và các nguồn đã đƣợc nghiên cứu là có chứa hệ vi sinh vật đƣờng ruột để phân lập ra các chủng vi khuẩn lactic và phân lập bằng phƣơng pháp phân lập giống thuần khiết phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh.
Nhƣ đã đề cập ở mục 2.3.4.1, việc định danh LAB chủ yếu dựa vào các phƣơng pháp cổ điển (nhƣ dựa vào hình thái, cấu trúc, sinh lý, sinh hóa) theo Bergey’s Manual (Benson Lab Manual, 2001) cùng với việc kiểm tra khả năng lên men các loại đƣờng khác nhau và so sánh với khóa phân loại của Bergey để phân loại, định danh chúng đến cấp giống (hình 3.1 và 3.2).
Chọn môi trƣờng sử dụng trong suốt quá trình phân lập là môi trƣờng MRS trong đó có bổ sung thêm 0.02% natri azide (NaN3) do chất này gây ức chế quá trình hô hấp
SVTH: Dƣơng Thúy Vy 58
cho nên loại bỏ đƣợc các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, làm tăng tính chọn lọc của môi trƣờng đối với LAB và giúp lọai bỏ phần lớn các vi khuẩn gây bệnh.
Mục tiêu của đề tài tài là phân lập vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic. Vì vậy để xác định những chủng đã phân lập có mang hoạt tính của một probiotics hay không ta tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của chúng bằng cách cho chúng đối kháng trực tiếp với sinh vật chỉ thị là E. coli và Salmonella bằng phƣơng pháp đo độ đục (Turbidometric assay method).
Nếu xác định đƣợc các chủng phân lập đƣợc có tính kháng khuẩn cao thì đã đạt đƣợc mục tiêu của đề tài.
Hình 3.1: Sơ đồ phân lọai vi khuẩn theo kết quả nhuộm Gram và hình thái (theo khóa phân lọai của Bergey)
SVTH: Dƣơng Thúy Vy 59
Hình 3.2: Sơ đồ các bƣớc phân lập và định danh vi khuẩn lactic
Hình cầu Hình que
Nhuộm bào tử
+
Cấy truyền sang MRS agar
Phân lập giống thuần khiết
Nhuộm Gram Quan sát hình thái tế bào Tăng sinh trong MRS broth
_ Đều Quan sát đều, không đều Nhuộm kháng acid Catalase + Định tính acid lactic
Kiểm tra khả năng di động