- Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo và Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.7. Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phƣơng pháp đo độ đục (turbidimetric method).
(turbidimetric method).
* Mục đích:
Những vi sinh vật mang đặc tính probiotic phải là những sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh nên trong thí nghiệm này cần phải kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh của những chủng vi khuẩn LAB phân lập đƣợc nhằm tuyển chọn những chủng mang đặc tính probiotic trong đó vi khuẩn E. coli
và Salmonella đƣợc chọn làm vi sinh vật chỉ thị.
* Nguyên tắc:
Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trƣởng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trƣờng cũng làm cho môi trƣờng trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Do đó, thông qua việc đo độ đục bằng máy quang phổ kể ở bƣớc sóng 610nm của dịch huyền phù tế bào ta có thể định tính đƣợc mật độ vi sinh vật ở điều kiện cần khảo sát
Dựa trên khả năng kháng khuẩn của các sản phẩm trao đổi chất của LAB đối với vi sinh vật chỉ thị trong môi trƣờng lỏng. Vi sinh vật chỉ thị bị ức chế tăng trƣởng dẫn đến nồng độ tế bào giảm so với đối chứng
Ống đối chứng là sự phát triển bình thƣờng của VK chỉ chị E. coli. Ống kiểm tra là ống có chứa dịch nuôi LAB đã ly tâm, nếu vi khuẩn LAB có tính kháng khuẩn thì ống kiểm tra sẽ có mật độ tế bào thấp hơn ống đối chứng.
SVTH: Dƣơng Thúy Vy 66 Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 2 nghiệm thức :
+ Nghiệm thức 1: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và Salmonella bằng các chất đƣợc sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB.
+ Nghiệm thức 2 : xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và Salmonella bằng các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB nhƣng đã đƣợc loại bỏ yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa bằng dung dịch NaOH 1N.
* Chuẩn bị :
Dịch nuôi cấy E.coli và Salmonella (ủ 21h, 370C) pha loãng 10-2 tƣơng ứng nồng độ tế bào 105
tế bào/ml.
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS broth ủ kị khí 18- 24h, ở 37oC , mang 1 nửa đi trung hòa về pH 6 bằng NaOH 1N, thanh trùng ở 80oC trong 10 phút, sau đó ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút, loại bỏ sinh khối.
*Cách thực hiện:
Ống thí nghiệm : gồm 1 ml dịch nuôi cấy E.coli hoặc Salmonella nồng độ 105 tế bào/ml với 1 ml dịch ly tâm LAB (trung hòa hoặc không trung hòa), bổ sung 8 ml môi trƣờng cao thịt-peptone. Ủ hiếu khí 37oC, 24 giờ .
Ống đối chứng : giống ống thí nghiệm, nhƣng 1 ml dịch ly tâm LAB đƣợc thay bằng 1ml MRS broth đã tiệt trùng.
Ống trắng : gồm 9ml môi trƣờng cao thịt-peptone và 1ml MRS broth đã tiệt trùng.
Tiến hành đo độ đục của tất cả các ống bằng máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 610nm.
* Công thức tính toán:
Tỉ lệ sống sót của VSV chỉ thị (%) = ODTN/ODĐC*100 % OD = ODĐC / ODTN * 100%
Nhƣ vậy với %OD càng nhỏ thì khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó càng cao.
SVTH: Dƣơng Thúy Vy 67 ODTN : giá trị OD của ống thí nghiệm. % vi sinh vật chỉ thị bị ức chế đƣợc tính nhƣ sau:
D% = 100% - %OD , thể hiện khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó, D% càng lớn, khả năng kháng vi sinh vật càng cao.
Chú ý: kết quả thu được là số liệu trung bình của 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa thống kê 95%.