2.6.1. Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng
Ngƣời bị viêm màng não mủ thƣờng có những biểu hiện nhƣ sốt cao, nôn mửa, đau đầu dữ dội, cứng cổ, sợ ánh sáng, mất ý thức…
2.6.2. Phƣơng pháp xét nghiệm vi khuẩn học
Dịch não tủy đƣợc đem ly tâm lấy phần cặn lắng để nhuộm gram tìm vi khuẩn. Có thể soi nhìn thấy đƣợc vi khuẩn hay không tùy thuộc vào số lƣợng vi khuẩn bị nhiễm. Nếu số lƣợng này lên đến 105/ml thì có thể soi (+) trong 97% các trƣờng hợp. Tỷ lệ nhuộm (+) cũng tùy thuộc vào loại vi khuẩn.
Dịch não tủy đƣợc đem cấy vào môi trƣờng thạch máu hay thạch sô-cô-la. Cấy dịch não tủy có thể dƣơng tính trong 70 – 80% các trƣờng hợp viêm màng não mủ.
2.6.3. Phƣơng pháp miễn dịch học
Phƣơng pháp điện di miễn dịch ngƣợc chiều (Counter Immuno Electrophoresis) xác định đƣợc viêm màng não do H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis A, B, C, Y và W 135 trong vòng vài giờ.
Phản ứng ngƣng kết với latex nhạy hơn phƣơng pháp CIE, cho kết quả trong 4 giờ, giúp phát hiện kháng nguyên polysaccharide trong H. influenzae type b, S. pneumoniae, N. meningitidis và Streptococcus nhóm B.
2.6.4. Phƣơng pháp tế bào học
Tế bào dịch não tủy phải đƣợc khảo sát ngay, vì sau 90 phút, các bạch cầu của dịch não tủy sẽ bắt đầu thoái hóa. Trong trƣờng hợp bệnh viêm màng não mủ, lƣợng tế bào có thể từ 100 – 1000/mm3, trong đó bạch cầu đa nhân trung tính chiếm đa số (trên 80%). Trong những trƣờng hợp viêm màng não mủ đang điều trị dở dang, số lƣợng các tế bào đơn nhân có thể cao hơn đa nhân.
Công thức Dejong
Nếu bạch cầu đếm đƣợc trong dịch não tủy lớn hơn số lƣợng trên chính là số lƣợng bạch cầu viêm. Nếu bạch cầu viêm trên 10/mm3 cho phép kết luận có sự tăng bạch cầu dịch não tủy, nghĩa là có hiện tƣợng viêm.
2.6.5. Phƣơng pháp sinh hoá
2.6.5.1. Đƣờng trong dịch não tủy
Trong viêm màng não mủ, lƣợng đƣờng ở dịch não tủy thƣờng thấp hơn đƣờng huyết 50 – 60%. Một số ít trƣờng hợp đƣờng dƣới 10 mg%. Đƣờng trong dịch não tủy thấp có giá trị phân biệt viêm màng não mủ với các viêm màng não siêu vi hay các nhiễm trùng cạnh màng não.
2.6.5.2. Đạm trong dịch não tủy
Đạm trong dịch não tủy tăng cao, khoảng 100 mg%. Nếu đạm trong dịch não tủy tăng lên trên 1000 mg% phải nghĩ đến tắc nghẽn khoang dƣới nhện thứ phát. Ngoài ra, khi dịch não tủy bị chạm thƣơng, nồng độ đạm có thể gia tăng hơn: cứ 1000 hồng cầu sẽ tăng 0,1 mg/ml.
2.6.5.3. Phƣơng pháp khảo sát nồng độ lactate
Lactate là chất đƣợc sản sinh từ quá trình chuyển hóa kỵ khí của glucose. Nó là một yếu tố quan trọng giúp chẩn đoán bệnh. Trị số lactate dịch não tủy tăng cao trên 4 mmol/l trong viêm màng não mủ. Độ nhạy cảm của thông số này khá cao so với các thông số khác nhƣ đạm, đƣờng. Trị số này sẽ giảm trong quá trình đáp ứng với điều trị.
2.6.6. Phƣơng pháp chụp cắt lớp – CT (Computer Tomography)
Phƣơng pháp chụp cắt lớp điện toán – CT sọ não không có ích cho chẩn đoán nhƣng có thể chỉ định cho bệnh nhân cứ sốt dai dẳng, có biểu hiện tăng áp lực nội sọ, liệt khu trú, co giật, vòng đầu to, rối loạn thần kinh kéo dài, hoặc kết quả cấy và các thông số của dịch não tủy bất thƣờng kéo dài để xác định biến chứng. Ở trẻ có sốt và nghi ngờ có tràn dịch dƣới màng cứng nên chụp CT để phát hiện và dẫn lƣu. Đặc biệt ở bệnh nhân viêm màng não mủ do vỡ nền sọ có thoát dịch não tủy, chụp CT có thể phát hiện mức độ khí – dịch, độ mờ của xoang mũi hoặc khí nội sọ. CT cắt dọc có thể định vị đƣợc vị trí vỡ xƣơng. Chụp CT có thể sử dụng chất cản quang tạo độ tƣơng phản rõ giữa dịch – chất hòa tan là cách tốt nhất để xác định vị trí thoát dịch.
2.6.7. Phƣơng pháp xét nghiệm dựa vào kỹ thuật PCR
Phƣơng pháp PCR là một phƣơng pháp mới để xét nghiệm bệnh viêm màng não mủ. Phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm nhƣ độ nhạy, độ chính xác cao, cho phép phát hiện trực tiếp và chính xác vi khuẩn gây bệnh trong thời gian ngắn, kĩ thuật thao tác đơn giản và nhanh chóng trên một lƣợng dịch não tủy ban đầu ít. Mặt hạn chế của phƣơng pháp này là sự ngoại nhiễm cao.
2.7. KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ
2.7.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Sau đó DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đã đƣợc hình thành dựa trên các đặc tính đó của DNA polymerase. Vậy nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự, ta sẽ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi.
Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm có: DNA bản mẫu, mồi xuôi và mồi ngƣợc, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP,dTTP), dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2, Taq polymerase.
2.7.2. Quy trình của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc và mỗi chu kỳ sẽ tăng gấp đôi số lƣợng mẫu lần trƣớc (nhân bản theo cấp số nhân).
Bƣớc 1: Giai đoạn biến tính
Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thƣờng ở 90o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C – 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp (lai)
Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC tuỳ thuộc Tm các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài
Nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất (DNA polymerase sử dụng là DNA polymerase chịu nhiệt). Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần nhân bản.
2.7.3. Seminested PCR/ multiplex PCR 2.7.3.1. Seminested PCR 2.7.3.1. Seminested PCR
Đây là một trong những kỹ thuật phát triển sau này dựa vào nền tảng kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này gồm hai bƣớc:
Bƣớc 1: là sự nhân bản một trình tự DNA.
Bƣớc 2: là sự nhân bản các bản mẫu là các đoạn DNA vừa đƣợc nhân bản. Đoạn DNA đƣợc nhân bản trong bƣớc 2 nằm trong đoạn DNA đƣợc nhân bản trong bƣớc 1. Một trong hai mồi sử dụng ở bƣớc 1 sẽ đƣợc sử dụng lại trong bƣớc 2 để cùng mồi mới tạo thành một cặp mồi. Sau bƣớc đầu tiên, các đoạn DNA chứa đoạn DNA cần nhân bản ở bƣớc 2 đã đƣợc nhân lên rất nhiều so với lƣợng DNA ban đầu. Do đó, ở bƣớc 2, lƣợng bản mẫu sẽ nhiều hơn lƣợng DNA không mong muốn nên sự nhân bản các đoạn DNA mong muốn sẽ diễn ra dễ dàng hơn, dẫn đến sự nhân bản đặc hiệu hơn.
2.7.3.2. Multiplex PCR
Multiplex PCR là một kỹ thuật dùng nhiều cặp mồi khác nhau trong cùng một phản ứng PCR để nhân bản đồng thời nhiều đoạn trình tự. Số lƣợng các sản phẩm PCR khác nhau đƣợc nhân bản trong cùng một phản ứng PCR có thể từ 2 sản phẩm đến tối đa 15 sản phẩm, điều này có nghĩa là có thể dùng đến 15 cặp mồi trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật này đƣợc thử nghiệm thành công vào năm 1988 và từ đó đã đƣợc áp dụng thành công trong nhiều công trình nghiên cứu về các biến đổi di truyền ở ngƣời cũng nhƣ nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác.
Kỹ thuật multiplex PCR thƣờng dùng để kết hợp với kỹ thuật nested PCR hay seminested PCR nhằm thu đƣợc kết quả với độ chính xác và độ đặc hiệu cao.
2.7.4. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ màng não mủ
Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm, xen kẽ với các vùng biến động khác nhau giữa các loài trong nhóm. Do đó, những trình tự này rất phù hợp với mục đích thiết kế mồi nhằm phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn và các kỹ thuật chẩn đoán dựa vào kỹ thuật PCR ngày càng đƣợc phát triển với mục đích tăng độ nhạy của phản ứng.
Năm 1994, Radstrom và các cộng sự đã đề ra phƣơng án sử dụng cặp mồi u3 và ru8 để nhân bản vùng trình tự bảo tồn trên gene 16S rRNA trong bƣớc đầu và sử dụng
mồi ru8 với các mồi đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn để nhân bản vùng trình tự đặc biệt của mỗi loài trong bƣớc 2. Kỹ thuật tiếp tục đƣợc nhóm nghiên cứu phát triển (năm 1998) để phát hiện đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ trong dịch não tủy nhƣ Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae và Listeria monocytogenes.
Cũng vào năm 1994, Greisen và các cộng sự công bố công trình nghiên cứu những mồi và mẫu dò cho gene 16S rRNA của hầu hết các loài vi khuẩn gây bệnh, bao gồm vi khuẩn tìm thấy trong dịch não tủy. Đầu tiên là sự nhân bản vùng trình tự bảo tồn trên gene 16S rRNA bằng phƣơng pháp PCR. Sau đó sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện DNA các loài vi khuẩn.
Tƣơng tự các công trình nghiên cứu trƣớc, Jang – Jih Lu và các cộng sự vào năm 2000 cũng đã thiết lập một cặp mồi chung trên gene 16S rRNA cho các loài vi khuẩn
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis để thiết lập phản ứng PCR nhân bản đoạn có kích thƣớc 996 bp. Ở bƣớc 2 tác giả sử dụng enzyme cắt giới hạn phân cắt đoạn trình tự lớn 996 bp. Các sản phẩm PCR sau khi đã xử lý bằng enzyme sẽ đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 6% và so sánh với thang chuẩn để xác định sự hiện diện của vi khuẩn trong dịch não tủy.
Qua một số công trình nghiên cứu trên, chúng tôi thấy hầu hết việc phát hiện vi khuẩn gây viêm màng não mủ đều trải qua bƣớc cơ bản là nhân bản 1 trình tự bảo tồn. Do đó, trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi tiến hành thu thập các trình tự gene
16S và 23S rRNA bảo tồn trên các loài vi khuẩn và lƣu trữ trong CSDL. Từ các trình tự này chúng tôi sử dụng phần mềm Primrose để thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ.
2.8. GENE 16S rRNA VÀ 23S rRNA
2.8.1. RNA ribosome (rRNA) – Cấu trúc ribosome
Sự tổng hợp các chuỗi polypeptide trong tất cả các hệ thống sống đƣợc thực hiện tại các ribosome. Ribosome của vi khuẩn có khối lƣợng khoảng chừng 2,5 triệu dalton, có hệ số lắng là 70S, trong đó protein chiếm 1/3 khối lƣợng và phần còn lại là các rRNA.
Tất cả các ribosome đƣợc hình thành từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein có kích thƣớc không bằng nhau. Ở vi khuẩn, những tiểu đơn vị này có hệ số lắng là 50S và 30S. Ribosome ở E. coli cũng nhƣ ở các loài vi khuẩn khác chứa 3 loại rRNA: 16S rRNA, 23S rRNA và 5S rRNA.
16S rRNA ở E. coli có chiều dài khoảng 1542 ribonucleotide là một thành phần cấu thành tiểu đơn vị nhỏ của ribosome. Tiểu đơn vị lớn của ribosome thì chứa hai loại rRNA là 23S và 5S (ở E. coli có chiều dài lần lƣợt là 2904 và 120 ribonucleotide). Ngƣời ta cho rằng rRNA đóng vai trò rất quan trọng trong cấu trúc của ribosome, giúp cho việc gắn kết của các protein ribosome và góp phần quyết định hình dạng của ribosome.
Thành phần cấu tạo của ribosome điển hình (ở vi khuẩn E. coli) bao gồm 55 phân tử protein có khối lƣợng khoảng 900 000 dalton, trong số này có 4 phân tử protein cùng loại, các phân tử còn lại là khác nhau. Tiểu đơn vị nhỏ của ribosome bao gồm 21 protein kết hợp với 16S rRNA, tiểu đơn vị lớn bao gồm 34 protein kết hợp với 23S rRNA và 5S rRNA.
Hình 2.7. Thành phần cấu tạo của ribosome ở prokaryote
Cho đến nay, chƣa có một kết luận hợp lý nào về sự xuất hiện một lƣợng lớn rRNA trong ribosome. Tuy nhiên, mọi ngƣời đều tin rằng các ribonucleotide không bắt cặp trong cấu trúc bậc 2 của rRNA có liên quan đến sự gắn kết của các RNA khác lên ribosome. Chẳng hạn một vài ribonucleotide ở gần đầu 3‟ của 16S rRNA là điểm bắt cặp với các nucleotide (trình tự Shine – Dalgarno) trên phân tử RNA thông tin (mRNA) để ribosome có thể gắn vào RNA thông tin và tiến hành tổng hợp chuỗi polypeptide. Tƣơng tự, một vài trình tự rRNA của ribosome cũng tƣơng tác với các trình tự của RNA vận chuyển (tRNA) khác nhau trong quá trình tổng hợp protein.
2.8.2. Gene 16S rRNA thƣớc đo tiến hóa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ năm 1967, Zuckerkand và Pauling đã đƣa ra ý kiến cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hoá” hay “thƣớc đo tiến hoá”. Để là một thƣớc đo tiến hóa, phân tử đƣợc chọn phải có các đặc điểm sau.
- Phân tử phải có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát. - Phân tử không đƣợc truyền qua lại giữa các loài.
- Trình tự của phân tử này phải có độ bảo tồn và biến động thích hợp trong khoảng cách tiến hóa khảo sát.
- Phân tử phải có kích thƣớc đủ lớn để chứa nhiều thông tin. Mặc dù các tRNA có mặt ở hầu hết các vi sinh vật nhƣng chúng không đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hóa do có kích thƣớc quá nhỏ (75 ribonucleotide).
Một thập kỷ sau, vào năm 1977, Woese và các cộng sự đã xác định 16S rRNA là phân tử rất thích hợp làm thƣớc đo tiến hóa. 16S rRNA là phân tử cổ, là thành phần của bộ máy tổng hợp protein có từ lâu đời. Hơn nữa, các rRNA là những phân tử có chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải cho phép phản ảnh sự liên quan tiến hóa giữa các loài sinh vật.
Ba loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hóa. Tuy nhiên, 5S rRNA có kích thƣớc quá nhỏ (khoảng 120 ribonucleotide), mang ít thông tin của quá trình tiến hóa nên ít đƣợc chọn. 23S rRNA là phân tử lớn (có khoảng 2900 ribonucleotide), có đầy đủ các tính chất để có thể làm thƣớc đo tiến hóa. Tuy nhiên, kích thƣớc của 23S rRNA lớn nên thao tác nghiên cứu trên phân tử này không thuận lợi lắm. Phân tử 16S rRNA có kích thƣớc vừa phải, khoảng 1500 ribonucleotide, thuận lợi cho các thao tác nghiên cứu nên hiện nay, phân tử này đƣợc coi nhƣ là “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học. Tuy nhiên, do RNA đòi hỏi phải rất cẩn trọng trong thao tác do dễ bị phân hủy nên khuynh hƣớng hiện nay là sử dụng gene mã hóa cho RNA – gọi là gene 16S rRNA – trong các nghiên cứu. Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có một điểm rất đặc biệt là có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau giữa các loài trong cùng nhóm này. Tuy là những vùng biến động, nhƣng những vùng này lại là những vùng bảo tồn ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở các cấp độ khác nhau đã giúp cho gene 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên của các nhà nghiên cứu khi tiến hành định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn. Cho đến nay, số lƣợng các gene 16S rRNA đã đƣợc giải trình tự lên đến hơn 10 000. Điều này cho thấy có sự quan tâm rất lớn của các nhà