II. TÁI BẢN DNA
1.Các nguyên tắc và đặc điểm chung của tái bản DNA
1.1 Sự tái bản DNA theo cơ chế bán bảo tồn (semi-conservative mechanism)
Ưu điểm nổi bật của mô hình Watson – Crick là cho phép dự đoán ngay được cơ chế tái bản của DNA. Ngay sau khi mô hình cấu trúc DNA được nêu ra, nhiều thí nghiệm được tiến hành để xác nhận các dự đoán.
Trong chuỗi xoắn kép DNA, hai mạch đơn liên kết với nhau bằng một quan hệ bổ sung. Như vậy, trong quá trình tái bản, nếu hai mạch đơn tách rời nhau và mỗi mạch đơn được dùng làm khuôn để tổng hợp nên một mạch mới theo nguyên tắc bổ sung thì kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu đã tạo ra được hai phân tử mới giống hệt nhau. Vì trong
mỗi phân tử DNA con đều mang một mạch cũ và một mạch mới nên kiểu tái bản này được gọi là bán bảo tồn.
Cơ chế bán bảo tồn đã được Meselson và Stahl chứng minh bằng thực nghiệm vào năm 1958. Người ta nuôi E.coli trong môi trường có nguồn N15, tế bào sẽ sử dụng N15 để tổng hợp DNA cho đến khi tất cả DNA của vi khuẩn đều mang đồng vị nặng N15. Sau đó các tế bào được chuyển sang môi trường có chứa N14. Cách khoảng thời gian đều đặn tương ứng với mỗi đợt phân bào, người ta lấy các tế bào đem chiết tách DNA. Bằng phương pháp ly tâm trong gradient tỉ trọng CsCl, các loại DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra, kết quả phân tích phù hợp với kiểu tái bản bán bảo tồn.
1.2 Cơ chế phân tử của quá trình tái bản DNA
Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm ra cơ chế phân tử của quá trình tái bản. Đó là một quá trình phức tạp có sự khác biệt ở prokaryote và eukaryote nhưng phải trải qua cơ chế chung sau:
• Các liên kết hydrogen ổn định cấu trúc xoắn và liên kết hai mạch đơn với nhau phải được phá vỡ để tách rời hai mạch.
• Phải có đoạn mồi (primer), tức là đoạn DNA/RNA ngắn, bắt cặp bổ sung với mạch khuôn để tạo đầu 3’OH tự do.
• Nguyên liệu tổng hợp DNA là các desoxynucleosid 5’-triphosphate (dNTPs): dATP, dGTP, dCTP và TTP.
• Mạch khuôn luôn được đọc theo chiều 3’-5’ trong khi mạch mới được tổng hợp theo chiều 5’-3’. Mỗi nucleotide mới được gắn vào đầu 3’OH của mạch đang kéo dài bằng liên kết cộng hoá trị. Năng lượng cho sự polymer hoá đến từ việc thủy phân các dNTPs, loại ra các pyrophosphate.
• Mỗi bước được thực hiện một cách nhanh chóng, chính xác dưới sự điều khiển của enzyme đặc hiệu.
1.3 Đơn vị tái bản, điểm khởi đầu và điểm kết thúc tái bản
Mỗi đoạn DNA được tái bản như là một đơn vị riêng lẻ được gọi là một đơn vị tái bản (replicon). Các DNA dạng vòng, kích thước nhỏ (chẳng hạn như nhiễm sắc thể của vi khuẩn và DNA virus) chỉ gồm một đơn vị tái bản duy nhất. Sự tái bản khởi đầu từ một điểm gọi là điểm khởi đầu sao chép (origin) và lan ra theo hai hướng, hình thành hai chạc ba tái bản (replication fork) cho đến khi gặp nhau tại điểm kết thúc (terminus). Điểm khởi đầu tái bản có khuynh hướng giàu A-T để dễ dàng khởi đầu tách rời hai mạch đơn.
Ở eukaryote, mỗi phân tử DNA bao gồm nhiều đơn vị tái bản. Mỗi đơn vị tái bản có điểm khởi đầu riêng và sự tái bản cũng lan ra theo hai hướng. Khi các chạc ba tái bản gặp nhau thì sự tái bản DNA được hoàn thành. Ví dụ như tế bào hữu nhũ điển hình có từ 50.000 – 100.000 đơn vị tái bản, mỗi đơn vị tái bản có kích thước khoảng 40 – 200 kb.
1.4 Sự tổng hợp mạch mới của DNA xảy ra liên tục trên một mạch và gián đoạn trênmạch kia (Semi-discontinuous replication - Tái bản bán gián đoạn) mạch kia (Semi-discontinuous replication - Tái bản bán gián đoạn)
Trong tái bản bán bảo tồn, cả hai mạch mới của DNA được tổng hợp đồng thời ở mỗi chạc ba tái bản. Tuy nhiên, cơ chế tái bản DNA chỉ cho phép sự tổng hợp theo hướng 5’– 3’, vì thế trên hai mạch khuôn có hướng ngược nhau, sự tổng hợp mạch mới không diễn tiến giống nhau.
• Từ điểm khởi đầu tái bản, trên mạch khuôn 3’- 5’ sự tổng hợp mạch mới diễn ra một cách liên tục theo chiều 5’- 3’ cùng chiều với hướng tháo xoắn. Mạch này được gọi là mạch tới (leading strand).
• Trong khi đó trên mạch khuôn 5’ – 3’, sự tổng hợp mạch mới cũng diễn ra theo hướng 5’ – 3’ nhưng ngược với hướng tháo xoắn. Chính vì thế, sự tổng hợp mạch mới không xảy ra liên tục mà dưới dạng những đoạn ngắn được gọi là đoạn Okazaki (kích thước 1000 – 2000 bp ở prokaryote và 100 – 200 bp ở eukaryote).
Mạch mới được tổng hợp theo kiểu gián đoạn này được gọi là mạch chậm (lagging strand).
Trên thực tế, sự tổng hợp cả hai mạch theo cùng hướng vì mạch khuôn chậm được uốn vòng để quay 180o tại chạc ba tái bản, trở nên cùng hướng với mạch khuôn tới.
1.5 Mồi RNA
Mạch tới và tất cả những đoạn Okazaki của mạch chậm chỉ có thể được tổng hợp bằng cách kéo dài một mồi đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn. Mồi là một đoạn RNA ngắn, được tổng hợp bởi một phức hợp protein gọi là primosome bao gồm nhiều protein và một enzyme có tên là primase. Ví dụ, ở E. coli, phức hợp primosome bao gồm các Dna B helicase (tách rời hai mạch đơn) và DNA primase (tổng hợp mồi RNA từ khuôn DNA).
Các mồi RNA này sau đó sẽ bị phân hủy bởi RNase và được thay bằng trình tự DNA nhờ vào hoạt động của DNA polymerase. Enzyme ligase sẽ nối liền các đoạn DNA lại với nhau.
Cơ chế dùng mồi là RNA thay vì DNA dường như liên quan đến tính chính xác cao trong tái bản DNA và hoạt tính sửa sai của các DNA polymerase.