II. Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu:
3.4.2. Phương pháp xác ñịnh nồng ñộ ñường khử của dung dịch nuôi cấy xạkhuẩn bằng phương pháp DNS (dinitro salicylic acid) [1, 12].
3.4.2.1. Nguyên tắc
Một ñơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme cần thiết ñể giải phóng ra ñường khử (như glucose) khi thuỷ phân CMC ở tốc ñộ 1µmol/phút dưới các ñiều kiện phản ứng.
Phương pháp này dựa vào sự thủy giải cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bằng enzyme cellulase ở pH 5.0 và 400C. Enzyme cellulase sau phản ứng phân giải cellulose sẽ tạo ra một lượng ñường khử, ñường khử sẽ phản ứng với DNS tạo thành phức màu ñỏ sậm và ñược xác ñịnh bằng máy ño mật ñộ quang ở bước sóng 540nm.
3.4.2.2. Tiến hành thí nghiệm
+ Các hoá chất cần chuẩn bị:
- Dung dịch cơ chất CMC 1%: cân chính xác 2.5g CMC khô, hoà tan vào 200ml nước, thêm vào 25ml acid acetic 1M, pH 5.0, chuyển qua bình ñịnh mức 250ml, thêm nước ñến vạch và lắc ñều.
- Cách pha chế thuốc thử DNS (dinitro salisilic acid) [12].
- Cân 10g DNS cho vào một cốc thuỷ tinh 1000ml thêm vào khoảng 500ml nước cất. Khuấy trên bếp khuấy từ.
- Hoà tan 16g NaOH với 150ml nước cất.
- Thêm dung dịch NaOH vừa pha từ từ vào dung dịch DNS ở trên. Sử dụng máy khuấn từ ñể hoà tan nhưng nhiệt ñộ không ñược quá 500C. - Tiếp tục cho thêm 300g potassium sodium tartrate tetrahydrate
(C4H4O6KNa.4H2O). Khuấy ñều bằng máy khuấy từ và gia nhiệt.
- Để nguội về nhiệt ñộ phòng, chuyển dung dịch sang bình ñịnh mưc 1000ml, thêm nước cất ñến vạch và lắc ñều.
- Bảo quản dung dịch trong chai thuỷ tinh màu tối có nắp ñậy, cần phải tránh ánh sáng và CO2.
- Dung dịch mẫu (dung dịch enzyme): Pha loãng ở nồng ñộ thích hợp.
+ Xây dựng phương trình ñường chuẩn của glucose
- Pha glucose 1mg/ml, pha glucose này với các nồng ñộ pha loãng: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 (mg/ml) theo bảng sau: Số thứ tự ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 Thể tích glucose (1mg/ml)(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Nồng ñộ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 CMC 1% (ml) 1 1 1 1 1 1 1 DNS (ml) 2 2 2 2 2 2 2 OD540nm
Sau khi cho hết các thành phần vào ống nghiệm, dùng giấy thiếc bịt kín ống nghiệm, lắc ñều, ñun cách thủy 1000C trong 15 phút, ñể nguội, ño OD540nm.
Từ kết quả ño OD xây dựng ñược phương trình ñường chuẩn của glucose.
+ Xác ñịnh nồng ñộ ñường khử của các dung dịch mẫu nuôi cấy xạ khuẩn phân giải cellulose.
- Hút 1ml dung dịch enzyme thu từ dung dịch nuôi cấy xạ khuẩn cho vào ống nghiệm, ñể ổn ñịnh nhiệt ở 400C trong 5 phút và ñể dung dịch CMC 1% ổn ñịnh ở nhiệt ñộ này trong 5 phút.
- Sau ñó thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc ñều, ñể phản ứng xảy ra ở 400C trong 10 phút.
- Thêm 2ml dung dịch DNS, lắc ñều, dùng giấy thiếc bịt kín miệng ống nghiệm, ñun cách thủy 1000C trong 15 phút, ñể nguội, ño OD540nm của các dung dịch mẫu. Dựa theo ñường chuẩn của glucose tính ñược nồng ñộ glucose của mẫu thí nghiệm.
33
Dùng nước cất làm ñối chứng. 3.4.2.3. Tính kết quả
- Giá trị hệ số glucose trung bình (F): F = (0.1/AG0.1+0.2/AG0.2+…..+0.6/AG0.6)/6 + F: Hệ số glucose (mg/ml).
+ AG: Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn.