Sắc ký là một kỹ thuật thƣờng đƣợc sử dụng trong các phịng thí nghiệm, với mục đích nhằm phân tách một hỗn hợp và định lƣợng các chất trong hỗn hợp đĩ. Hỗn hợp cần phân tích đƣợc pha với dung dịch gọi là pha động, nhờ đĩ chúng cĩ thể đi vào những chất giá cĩ cấu trúc giúp mang giữ và phân tách các chất tùy theo mục đích phân tách (theo khối lƣợng, theo ái lực, theo độ kỵ nƣớc,…) gọi là pha tĩnh. Các chất khác nhau cĩ tốc độ di chuyển trong pha tĩnh khác nhau, điều đĩ tạo nên sự phân tách giữa các chất trong hỗn hợp pha động. Phƣơng pháp sắc ký thƣờng chỉ cần một lƣợng nhỏ hỗn hợp để phân tích. Cĩ nhiều loại sắc ký đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng trên thế giới bao gồm: sắc ký lỏng, sắc ký khí, sắc ký ái lực, sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, sắc ký cột ….
Sắc ký hiệu năng cao HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - (High-performance liquid chromatography) hay cịn gọi là sắc ký lỏng cao áp (High-pressure liquid chromatography) là kỹ thuật thƣờng sử dụng trong hĩa học, sinh học để phân tích đặc tính của các chất hĩa học
hoặc các đoạn peptide ngắn theo khối lƣợng, độ kỵ nƣớc 31[31],... Cấu trúc của một hệ thống sắc ký HPLC các thành phần chính nhƣ sau: Một loại cột đƣợc nhồi chất giá cĩ bản chất khác nhau tùy mục đích phân tách: thƣờng đƣợc làm bằng thép khơng rỉ, chịu đƣợc áp suất cao. Chất giá nhồi trong cột thƣờng là các hạt silicagel cĩ bọc hoặc gắn hĩa học một màng mỏng chất hữu cơ cĩ kích thƣớc từ 3 đến 10 µm. Một hệ thống bơm chuyển pha động vào cột. Một detector làm nhiệm vụ phát hiện tín hiệu vào ra (Hình 1. 10).
Hình 1. 10: Mơ hình một hệ thống HPLC
Mẫu cần phân tích chỉ cần đƣa vào pha động bằng một thể tích nhỏ, sau đĩ pha động (bao gồm đệm và mẫu) sẽ đi qua pha tĩnh, nhờ ái lực mà mẫu đƣợc giữ lại, chỉ phân tách ở các thời điểm khác nhau khi cĩ các hĩa chất thích hợp ở nồng độ xác định.
Với sự phát triển của các kỹ thuật về sắc ký trong những năm gần đây, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trở thành phƣơng pháp ƣa thích cho việc tách và phân tích định lƣợng nhiều loại mẫu. Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và cĩ thể dị tìm lƣợng mẫu cĩ lƣợng nhỏ đến 200 pg30[30]. Các loại sắc ký cột mở, sắc ký bản mỏng, sắc ký giấy đƣợc sử dụng trong những trƣờng hợp tách đơn giản các chất,
cịn HPLC là kỹ thuật tách những hỗn hợp phức tạp và cĩ khả năng tách với độ phân giải cao với tốc độ nhanh và chất lƣợng tốt hơn.
Cĩ nhiều loại sắc ký HPLC tùy vào mục đích sử dụng cũng nhƣ tính chất của các chất cần phân tách mà ngƣời ta cĩ thể sử dụng các loại sắc ký HPLC sắc ký pha thƣờng (normal phase HPLC), sắc ký đảo pha (Reverse Phase-RP-HPLC), sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực…Sắc ký đảo pha là một kỹ thuật đƣợc sử dụng nhiều trong hệ thống HPLC để phân tách và tinh sạch các mảnh polypeptide nhỏ. Trong sắc ký đảo pha, protein đƣợc phân tách nhờ đặc tính phân cực của chúng. Pha tĩnh khơng phân cực, thƣờng cấu tạo bởi một hydrocarbon, pha động thƣờng phân cực ví dụ nhƣ nƣớc, methanol, propanol hoặc acetolnitrile trộn với mẫu cần phân tách. Hỗn hợp protein và các đoạn peptide khơng phân cực hoặc phân cực thấp sẽ lần lƣợt phân tách ra ngồi trong hoặc ngay sau khi đƣa mẫu lên pha tĩnh. Khi bắt đầu tăng nồng độ chất phân cực trong đệm (chất cạnh tranh), phân tử cĩ độ phân cực thấp bắt đầu đi ra trƣớc, sau đĩ dần dần, những chất cĩ độ phân cực cao hơn bắt nối tiếp theo sau.
Hình 1. 11: Mơ hình mơ tả sự hấp thụ và thơi một đoạn peptide ở pha tĩnh của sắc ký đảo pha. Polypeptide nằm trong pha động đi vào cột, các “chân” kỵ nƣớc của bề mặt vật liệu trong pha đảo sẽ giữ các polypeptide lại, cho đến lúc nồng độ của chất cạnh tranh trong pha động đạt đƣợc giá trị tới hạn thì các polypeptide sẽ đƣợc thơi ra41[41].
Đoạn polypeptide đi vào pha tĩnh của cột sắc ký đảo pha
Polypeptide được hấp thụ vào bề mặt của chất giá
Polypeptide được thơi ra khỏi pha tĩnh khi nồng độ của chất cạnh tranh đạt đến khoảng tới hạn