coli BL21.
Cơ sở lý thuyết: Tế bào vi khuẩn E.coli tái tổ hợp mang gene tổng hợp IL-2 đƣợc nuơi cấy trên mơi trƣờng LBA ở 37°C, 200 v/p. Nhờ cơ chế cảm ứng operon lac bằng hĩa chất IPTG, protein IL-2 đƣợc tổng hợp sau 5 giờ.
Cách tiến hành: Một khuẩn lạc đƣợc nuơi lắc qua đêm trong 2 mL LB cĩ bổ sung Ampicilin đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/mL (LBA). Sau đĩ chuyển 30 µL dịch nuơi cấy sang 100 mL mơi trƣờng LBA lắc trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 37°C
đến khi OD600 đạt khoảng từ 0,6 đến 0,8 thì bắt đầu bổ sung IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1mM để cảm ứng, rồi tiếp tục nuơi lắc ở 37°C. Mẫu đƣợc thu lại sau khi cảm ứng 4 giờ, bằng máy ly tâm ở tốc độ 5000 v/p trong 5 phút.
2.2.4 Phương pháp giải trình tự gene
Thành phần của phản ứng khuyếch đại DNA của phƣơng pháp giải trình tự gồm: 3,2 pM mồi, 200 ng DNA plasmid, BigDye, đệm dùng cho BigDye trong tổng thể tích 20 µL với chu trình nhiệt trên máy PCR nhƣ sau: 96°C-1 phút; 25 chu kỳ (96°C-10 giây, 50°C-10 giây, 60°C-4 phút); bảo quản ở 4°C.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch, kết tủa và làm khơ DNA, bổ sung 10µL Hi-Di Formamid và biến tính ở 95°C trong 5 phút. Các mẫu đƣợc đƣa vào các giếng của khay đựng mẫu sau đĩ điện di bằng máy trong ống vi mao quản 80 cm x 50 µm chứa POP-4 (ABI-Mỹ). Trình tự đọc đƣợc sẽ đƣợc xử lý bằng phần mềm Avant Data Collection v1.0.
2.2.5 Tối ưu hĩa điều kiện lên men bằng phần mềm Design expert 7.0.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng IL-2: Để tối ƣu bằng phần mềm, các yếu tố ảnh hƣởng đến năng suất tạo IL-2 đƣợc khảo sát trƣớc, bao gồm: nhiệt độ lên men, nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian thu mẫu, và OD bắt đầu cảm ứng. Các điều kiện để lên men đƣợc chọn để làm chuẩn là nhiệt độ lên men 37°C, nồng độ IPTG 1 mM, thời gian thu mẫu 5 giờ, OD bắt đầu cảm ứng từ 0,6 đến 0,8. Khi tiến hành khảo sát yếu tố nào thì thay đổi yếu tố đĩ và giữ nguyên giá trị của các yếu tố cịn lại theo điều kiện chuẩn.
Tối ưu điều kiện lên men nhằm thu được sản lượng IL-2 lớn nhất bằng phần mềm chuyên dụng: Sau khi xác định đƣợc các yếu tố chính ảnh hƣởng đến sản lƣợng IL- 2, mơ hình RSM-CCD giúp xác định giá trị tối ƣu và đƣợc nghiên cứu ở 3 mức ( -1, 0, +1, ), trong 15 hoặc 20 thí nghiệm tùy thuộc vào lựa chọn thiết kế. Chọn các điểm tại đĩ sản lƣợng IL-2 sau khảo sát cao nhất làm giá trị trung tâm (giá trị 0),
chọn giá trị thấp nhất và cao nhất của từng yếu tố mà tại đĩ sản lƣợng IL-2 bắt đầu bị ảnh hƣởng làm giá trị tới hạn (-1) và (+1).
Hình 2. 1: Cơng cụ RSM-CCD của phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0
Trong phần mềm design expert 7.0, bƣớc đầu tiên chọn File/New Design. Trong thẻ Respone Curface chọn Central Composite (Hình 2. 1). Trong phần Numberic Factors chọn 3 yếu tố ảnh hƣởng đến sản lƣợng IL-2. Khai tên, giá trị tới hạn (-1 và +1). Chọn kiểu thí nghiệm đầy đủ (20 thí nghiệm) hoặc rút gọn (15 thí nghiệm). Sau khi đã nhập đầy đủ thơng tin phần mềm sẽ cho ra 20 thí nghiệm để tiến hành, kết quả thu đƣợc từ 20 thí nghiệm đĩ đƣợc nhập tiếp tục vào phần kết quả. Từ đĩ sẽ cho ra những điểm tối ƣu mà hàm lƣợng IL-2 đạt giá trị cao nhất.
Cơng việc cuối cùng để hồn thiện tối ƣu là tiến hành thí nghiệm với các điểm tối ƣu đĩ so sánh với 20 thí nghiệm đã tiến hành để kiểm chứng.
2.2.6 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide.
Cơ sở lý thuyết: Điện di là quá trình dịch chuyển của phân tử dƣới tác dụng của điện trƣờng qua các mạng lƣới. Các phân tử cĩ tốc độ di chuyển tùy thuộc vào điện tích, kích thƣớc khối lƣợng, hình dạng phân tử. Protein đƣợc xử lý với SDS là chất mang điện âm cĩ khả năng bám vào protein làm protein tích điện tích âm đồng thời biến tính protein, tạo dạng thành dạng thẳng. Do cùng cĩ điện tích và là dạng thẳng nên protein cĩ tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thƣớc, khối lƣợng.
Các dung dịch cần dùng: Để chế 1 bản gel Acrylamide cần: Bis-Acrylamide 30%, APS 10%, Glyxerol 50%, TEMED. Đệm Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 cho gel tách. Tris- HCl 0,5 M pH 6,8 cho gel cơ. Đệm chạy điện di 6x: 7 mL Tris HCl pH 6,8; 3 mL Glycerol 100%; 1 g SDS; 1,2 mg Bromophenol blue; 0,6 mL 2-mecaptoethanol.
Bảng 2. 1 Cơng thức chế 1 bản gel acrylamide
Thành phần Gel tách (4,5 mL) Gel cơ (1 mL)
H2O 0,55 mL 0,45 mL Tris HCl 1,5M (pH8,8) 1,125 mL - Tris HCl 0,5M (pH6,8) - 0,3 mL Glycerol (50%) 0,9 mL - Bis/acrylamide 1,89 mL 0,14 mL SDS 10% 45µL 4 µL APS 30 µL 8 µL TEMED 3 µL 1 µL
Cách tiến hành: Các tế bào thu lại nhờ ly tâm đƣợc phá bằng đệm xử lý mẫu 6X và ủ ở 100oC trong 10 phút để phá tế bào, tích điện âm cho protein. Lắp bản gel, tra mẫu vào các giếng và chạy với cƣờng độ dịng cố định từ 20-30 mA trong khoảng 45 phút. Gỡ bản gel và đem nhuộm bạc, hoặc nhuộm comassie để xem kết quả. Nhuộm bạc: Gel đƣợc ngâm trong dung dịch cố định (Ethanol 50%, Acid acetic 12%, Formaldehyte 0,05%) lắc với thời gian khoảng 60 phút, sau đĩ rửa 3 lần với H2O 1X trong 20 giây, rửa bằng dung dịch rửa (Ethanol 100%) 2 lần, mỗi lần 20 phút. Sau đĩ cho vào dung dịch làm tăng độ nhạy (Na2S2O3 0,02%) lắc trong 10 phút. Rửa với H2O 1X 2 lần mỗi lần 20 giây. Nhuộm bản gel bằng dung dịch nhuộm bạc (AgNO3 0,2%; Formaldehyte 0,075%) trong 20 phút. Hiện màu các băng protein bằng dung dịch hiện màu (Na2CO3 6%; Na2S2O3 0,0004%, Formaldehyte 0,05%). Dừng phản ứng hiện màu bằng dung dịch dừng phản ứng (Glycine 0,5 g; H2O 50 mL).
Nhuộm comassie: Bản gel đƣợc gỡ ra và đem rửa với dung dịch rửa I (Methanol 10%, Acetic acid 10%) trong 10 phút. Sau đĩ nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm comassie từ 30 đến 60 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc tẩy màu bằng dung dịch rửa II ( Ethanol 35%, Glycerol 2%) cho tới khi sạch nền và các băng quan sát rõ nét.
2.2.7 Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Western Blot.
Cơ sở lý thuyết: Western Blot là phƣơng pháp xác định protein một cách đặc hiệu dựa vào phản ứng kháng nguyên kháng thể. Protein nằm trên gel SDS-PAGE đƣợc chuyển sang màng hấp thụ - Polyvinylidene diflouride (PVDF), sau đĩ protein đƣợc xác định bằng phản ứng giữa kháng thể 1 (kháng thể kháng với Interleukin 2- hãng sigma) và kháng thể 2 (kháng với kháng thể 1-hãng sigma) cĩ gắn với chất chỉ thị màu.
Cách tiến hành: Mẫu đƣợc tiến hành điện di theo phƣơng pháp SDS-PAGE, gỡ bản gel và chuyển màng bằng hệ thống chuyển màng semi-dry. Màng đƣợc ngâm trong methanol từ 5-10 phút. Song song với đĩ giấy thấm đƣợc ngâm trong
Blotting buffer 10 phút. Mở nắp máy và xếp các thành phần theo thứ tự từ dƣới lên trên: giấy thấm-màng PVDF – gel – giấy thấm. Chạy máy với hiệu điện thế 15 V trong 20 phút). Lấy màng ra khỏi hệ thống, phủ màng bằng sữa tách bơ skim milk 5% trong dung dịch TBS ở 4°C trong 1 giờ. Màng đƣợc rửa bằng dung dịch TTBS 3 lần, mỗi lần 10 phút và TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút. Màng sau khi rửa sạch sẽ đƣợc phủ kháng thể 1 và lắc ở nhiệt độ phịng. Sau 1 giờ phủ kháng thể màng tiếp tục đƣợc rửa bằng 2 dung dịch TTBS và TBS. Tiếp tục phủ kháng thể 2 và lắc ở nhiệt độ phịng. Sau khoảng 1 giờ lại rửa màng bằng TTBS và TBS. Hiện màu trong dung dịch hiện màu của BioRad (dung dịch TMB 1,5 mL).
2.2.8 Phá tế bào bằng phương pháp siêu âm và xử lý mẫu protein IL-2 trước khi tinh chế.
Cơ sở lý thuyết: Dƣới sự rung động của sĩng siêu âm, thành tế bào bị phá vỡ, protein, DNA đƣợc giải phĩng ra ngồi dung dịch mơi trƣờng. Xử lý trƣớc khi qua cột bằng các hĩa chất đƣa IL-2 từ dạng khơng tan chuyển thành dạng tan nhiều lần nhằm loại bớt các protein khơng mong muốn và tạp chất ra khỏi hỗn hợp nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất trƣớc khi tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký đảo pha HPLC.
Cách tiến hành:10 mL dịch tế bào tái tổ hợp E. coli sản xuất IL-2 (OD =100) đƣợc lấy từ tủ -80°C, bổ sung thêm 10 mL dung dịch 1 (Tris 20 mM; EDTA 10 mM; PMSF 0,05 mM), ủ ở 37°C trong bể ổn nhiệt. Sau 30 phút lấy hỗn hợp ra đem siêu âm phá tế bào lần thứ nhất 20-30 lần, mỗi lần 30 giây, giữa mỗi lần siêu âm nghỉ 10 giây, trong lúc thao tác mẫu đƣợc đặt trên đá. Ly tâm thu tủa ở tốc độ 10.000 v/p trong 10 phút, hịa tủa lại trong 10 mL dung dịch 2 (Tris 20 mM; EDTA 10 mM; PMSF 0,05 mM; Triton 100x 0,1-0,2%), vortex đề hịa lại tủa. Tiếp tục siêu âm phá tế bào lần thứ 2 với thơng số nhƣ lần đầu tiên. Bổ sung dung dịch 3 (sucrose 60%) đến nồng độ cuối cùng là 20%. Hỗn hợp đƣợc ly tâm thu tủa ở tốc độ 10.000 v/p trong 20 phút. Hịa lại tủa trong 5 mL dung dịch đệm 4 (Tris 50 mM; EDTA 10 mM; Guanidine 7 M) để làn tan protein. Ly tâm ở 10.000 v/p trong 30 phút thu dịch
nổi. Hịa dịch nổi với Tris 20 mM để nồng độ Guanidine cuối cùng là 2 M, để lắng trong 30 phút ở nhiệt độ phịng. Ly tâm thu tủa ở 10.000 v/p trong 30 phút. Hịa tủa lại trong dung dịch đệm 4, bổ sung β-mercaptoethanol 15 mM. Vortex trong điều kiện lạnh từ 8-10 giờ. Ly tâm 10.000 v/p trong 30 phút loại tủa và thu dịch nổi.
2.2.9 Tinh chế protein bằng hệ sắc ký đảo pha RP-HPLC.
Cơ sở lý thuyết: Phƣơng pháp sắc ký lỏng HPLC là phƣơng pháp phân tách bao gồm 2 pha, trong đĩ pha động là chất lỏng (dịch protein cần phân tách) và ph tĩnh chứa trong cột chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc cải biến bằng liên kết hĩa học với các nhĩm chức hữu cơ. Sắc ký đảo pha RP-HPLC phân tách IL-2 nhờ vào sự khác nhau giữa tính phân cực của các phân tử protein.
Cách tiến hành:Mẫu IL-2 đƣợc tiền xử lý ở quy trình 2.2.8, thu mẫu IL-2 sau bƣớc vortex qua đêm trong điều kiện lạnh, bổ sung TFA đến nồng độ cuối cùng là 0,1% nhằm giảm pH từ 8 xuống 3. Ly tâm 10.000 v/p trong 5 phút, thu dịch nổi. Đƣa mẫu lên cột sắc ký RP-HPLC theo chƣơng trình. Các thơng số cơ bản: Cột sắc ký để phân tách mẫu Biowire pore C5 (250 mm x 10 mm x 10 µm). Thể tích mẫu đƣa lên cột 200 µL. Tốc độ dịng chảy 5 mL/phút. Bƣớc sĩng của detector 280 nm. Chƣơng trình chạy:
Từ 0-6 phút: Chạy gradient từ 17% đến 50% đêm B (citric acid 0,1%; isopropanol 60%).
Từ 6 đến 17 phút: chạy 100% đệm B.
Từ 17 đến 22 phút chạy 100% đệm A (citric acid 0,1%).
Thu mẫu theo phân đoạn và điện di kiểm tra trên gel SDS-polyacrylamide 12,6%
2.2.10 Xác định độ tinh khiết của sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau khi tinh sạch. sạch.
Cơ sở lý thuyết: Sau khi tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký đảo pha RP-HPLC, mẫu đƣợc điện di bằng phƣơng pháp SDS-PAGE. Độ tinh sạch đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm bạc và phần mềm chuyên dụng Quatity One của hãng BioRad. Yêu cầu của sản phẩm là phải cĩ độ tinh khiết trên 95%.
Cách tiến hành: Sau khi điện di, lấy bản gel ra nhuộm comassie, rửa sạch bản gel để tránh sai số khi sử dụng phần mềm. Quét ảnh bằng hệ thống soi ảnh của BioRad, hoặc chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số chuyên nghiệp Canon. Nhập ảnh vào máy tính, sử dụng phần mềm Photoshop chuyển từ định dạng gốc sang định dạng .tif. Mở kết quả ảnh bằng phần mềm Quantity One bản quyền. Xác định các đƣờng chạy trên ảnh gel điện di bằng cơng cụ Lane frames. Chỉnh các cột vào chính giữa đƣờng chạy. Trên đƣờng chạy, xác định vị trí các băng bằng cơng cụ Add bands. Chú ý, mỗi băng protein vừa đƣợc chọn nên xác định bao trọn tồn bộ băng để tránh sai số. Tiếp theo xác định đƣờng nền cho phổ hấp phụ qua hai chức năng Sub-background và Lane background. Nháy chuột vào nút cơng cụ band in lane để truy suất kết quả dạng phổ hấp phụ của protein. Sử dụng chức năng Bands attributes để tính tốn mức hấp phụ trên mỗi thang protein. Kết quả đƣợc truy suất bởi cơng cụ Report.
2.2.11 Phương pháp xác định hàm lượng IL-2 bằng ELISA.
Cơ sở lý thuyết:Dựa vào nguyên lý miễn dịch bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể, chúng tơi đánh giá hàm lƣợng IL-2 trƣớc và sau tinh chế trên đĩa ELISA nhờ kháng thể 1 kháng với IL-2 và kháng thể 2 kháng với kháng thể 1, mang cấu trúc thủy phân cơ chất cĩ thể phát hiện bằng máy ELISA ở bƣớc sĩng 450 nm. Đây là phƣơng pháp khá nhạy và chính xác nếu cĩ IL-2 chuẩn đã biết hàm lƣợng.
Các dung dịch cần dùng: dung dịch PBS (NaCl 8g; KCl 0,2 g; Na2HPO4 1,15 g; KH2PO4 0,2 g; dH2O pha tới 1 L). Coating buffer: (NaHCO3 0,05 M; Na2CO3 0,05M). Wash solution (PBS 1L; Tween-20 0,05%). Blocking solution (BSA 1% pha trong PBS). Antibody diluent 1 (BSA 1%; Tween-20 0,05%; Cold fish gelatin
0,1% pha trong PBS). Antibody diluent 2 (Tween-20 0,05%, pha trong PBS). Acetate buffer 5x (CH3COONa 1 M; CH3COOH 0,04 M; pha trong dH2O). TMB 100X (0,01 g; DMSO 1mL; pha trong dH2O đến 1L). Dung dịch cơ chất (Acetate buffer 5x 2mL; TMB 100X 100µL; H2O2 30% 25µL; pha trong dH2O đến 1L).
Cách tiến hành: Phủ kháng nguyên trên đĩa: Pha lỗng kháng nguyên (mẫu cần đo) trong Coating buffer bổ sung 100 µL dịch pha lỗng vào mỗi giếng. Ủ đĩa khoảng 8-10 giờ ở 4°C. Loại Coating buffer và rửa mỗi giếng bằng 200 µL Wash Solution 3 lần. Khĩa dung dịch: Thêm 200 µL Blocking Solution vào mỗi giếng. Ủ 30 phút, sau đĩ loại bỏ dịch và rửa bằng 200 µL Wash Solution 3 lần. Phủ kháng thể 1: pha lỗng kháng thể đơn dịng kháng đặc hiệu IL-2 trong dịch pha lỗng kháng thể 1 (Antibody Diluents) với tỷ lệ tƣơng ứng là 1:5000. Bổ sung 100 µL dịch vừa chuẩn bị vào mỗi giếng. Ủ trong 60 phút rồi loại bỏ dịch bằng 200 µL Wash Solution 3 lần. Phủ kháng thể 2: Pha lỗng kháng thể kháng chuột gắn HRP trong dịch pha lỗng kháng thể 2 (Antibody Diluents 2) với tỷ lệ tƣơng ứng là 1:5000, bổ sung 100 µL dung dịch vừa chuẩn bị vào mỗi giếng. Ủ 60 phút, sau đĩ bổ sung 200 µL Wash solution để rửa 3 lần. Hiện màu bằng phản ứng enzyme cơ chất: Chuẩn bị dung dịch cơ chất (Acetate buffer 5x; TMB 100X, H2O2). Bổ sung 100 µL vào mỗi giếng. Ủ trong 30 phút rồi bổ sung 100 µL H2SO4 nồng độ 2 M vào mỗi giếng để dừng phản ứng. Cuối cùng sử dụng máy đọc ELISA chuyên dụng đo ở bƣớc sĩng 450 nm.
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nhằm làm tăng hoạt tính và giảm tính độc cho sản phẩm IL-2, chúng tơi đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm tạo đột biến mất amino acid Alanine ở đầu N, thay thế Cysteine ở vị trí 125 bằng Serine. Trình tự amino acid suy diễn từ trình tự DNA mã hĩa cho IL-2 giống hồn tồn so với trình tự amino acid của một sản phẩm IL-2 tái tổ hợp đã đƣợc FDA cơng nhận cấp phép và đã đƣợc sử dụng cho các bệnh nhân ung thƣ tế bào thận và ung thƣ ác tính. Đoạn gene này sau đĩ đƣợc tách dịng trong vector pET22b+ tạo thành vector tái tổ hợp dùng để biểu hiện trong E. coli BL21. Vector tái tổ hợp pET22-IL-2 sau đĩ đƣợc gửi đi giải trình tự để kiểm tra xem vector thu đƣợc cĩ mang đúng đoạn gene cần biểu hiện hay khơng. Là một sản phẩm cĩ thể sản xuất và tiêu thụ ra thị trƣờng, vì vậy làm sao để thu đƣợc lƣợng IL-