Các dịng tế bào vi khuẩn E. coli BL21 mang vector tái tổ hợp đƣợc nuơi cấy và tách chiết DNA plasmid phục vụ cơng việc giải trình tự gene. Vector pET22b(+) khơng chứa il2 sẽ cĩ kích thƣớc khoảng 5,5 kb trong khi vector pET22b(+) chứa il2
cĩ kích thƣớc khoảng 5,9 kb. Theo nguyên lý của điện di DNA phân tử cĩ khối lƣợng thấp hơn sẽ di chuyển trƣớc. Nhƣ vậy theo lý thuyết vector tái tổ hợp mang gen il2 sẽ di chuyển sau vector khơng mang gene.
Hình 3. 1: Kết quả điện di kiểm tra plasmid trên gel Agarose. Đƣờng chạy 1-3: plasmid các dịng mang vector tái tổ hợp pET22-IL-2 Đƣờng chạy 4: dịng mang vector pET22b(+).
Kết quả trên Hình 3. 1 cho thấy ở các dịng 1, 2, 3 là plasmid mang gene il2
xuất hiện băng cĩ kích thƣớc cao hơn ở đối chứng âm vector pET22b(+) khơng mang gene il2 kết quả này hồn tồn phù hợp với lý thuyết. Chứng tỏ chúng tơi đã thu đƣợc dịng vi khuẩn tái tổ hợp mang gene il2 mã hĩa cho Interleukin 2 ngƣời tái tổ hợp. Để xác định trình tự il2 dạng cải biến chúng tơi đã giải trình tự.
Đoạn DNA mang gene il2 đã cải cĩ kích thƣớc 396 bp mã hĩa cho IL-2 ngƣời đã đƣợc tách dịng trong vector pET22b(+). Dịng plasmid đƣợc kiểm tra trên máy ABI prism 3100. Trình tự đoạn DNA nhƣ sau:
cctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggattta P T S S S T K K T Q L Q L E H L L L D L cagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcaca Q M I L N G I N N Y K N P K L T R M L T tttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaa F K F Y M P K K A T E L K H L Q C L E E gaactcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaaga E L K P L E E V L N L A Q S K N F H L R cccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaaca P R D L I S N I N V I V L E L K G S E T acattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatgg 1 2 3 4
T F M C E Y A D E T A T I V E F L N R W attaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaact
I T F C Q S I I S T L T
Trình tự đƣợc dịch ra trình tự amino acid và so sánh với ngân hàng gene bằng cơng cụ BLAST:
IL-2 pha trƣớc 1 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ 58 -PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ IL-2 cải biến 1 -PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ 58
IL-2 pha trƣớc 61 CLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEF 117 CLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEF IL-2 cải biến 61 CLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEF 117
IL-2 pha trƣớc 118 LNRWITFSQSIISTLT 133 LNRWITFSQSIISTLT IL-2 cải biến 118 LNRWITFSQSIISTLT 133
Nhƣ vậy trình tự gene mã hĩa cho IL-2 sau khi cải biến so với đề tài nghiên cứu trƣớc “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thƣ” mã số KC.04.21/06/10) đã đƣợc thay đổi làm mất bộ ba mã hĩa cho amino acid Alanine ở vị trí đầu tiên trong trình tự protein IL-2. Kết quả cho thấy trình tự amino acid suy diễn từ trình tự il2 cải biến hồn tồn giống với trình tự amino acid của sản phẩm Aldesleukin[18] 18(hay cịn gọi là Proleukin) của hãng Chiron Hoa Kỳ sản xuất đƣợc FDA cơng nhận cĩ khả năng chữa trị ung thƣ, đƣợc FDA cơng nhận sử dụng để điều trị ung thƣ trên thế giới và đã hết hạn bảo hộ độc quyền.