b. Tối ƣu bằng phần mềm
3.5 Xác định độ sạch của mẫu IL-2 sau tinh chế bằng phần mềm Quantity
One.
Sau khi tinh sạch IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, chúng tơi tiến hành kiểm tra độ sạch của sản phẩm bằng phần mềm chuyên dụng Quantity One của Bio-rad. Để kiểm chứng cho phƣơng pháp chúng tơi sử dụng mẫu là IL-2 thơ sau tinh chế và IL-2 của Trung Quốc làm đối chứng dƣơng.
Kết quả ở Hình 3. 11 cho thấy ở mẫu IL-2 của Trung Quốc (TQ), là một sản phẩm sạch đã đƣợc kiểm tra chất lƣợng về độ tinh khiết đạt hơn 95%. Sản phẩm IL-
B A
2 TQ tồn tại 2 băng ở kích thƣớc 15 kDa và một băng cao khoảng 30 kDa, đây là dạng IL-2 kép dimer (kiểm tra bằng western blot bằng kháng thể đặc hiệu IL-2 vẫn phát hiện đƣợc băng này). Do vậy băng protein 30 kDa này vẫn chính là sản phẩm IL-2 và khơng ảnh hƣởng đến độ tinh khiết của sản phẩm. Từ Bảng 3. 2 độ sạch của thang protein chuẩn (fermentas) là 99%, mẫu IL-2 TQ cho tỷ lệ IL-2 đạt 95%, và mẫu IL-2 sau tinh chế của chúng tơi đạt đến 98%. Đây chính là giá trị độ tinh khiết của dịch protein IL-2 sau khi tinh chế. Với kết quả này, sản phẩm IL-2 tinh chế thu đƣợc sẽ tiếp tục xây dựng cơng thức bán thành phẩm và thử hoạt tính trên dịng tế bào đặc hiệu CTLL2 để xác định hoạt tính sinh học mong muốn.
Hình 3. 11: Xác định thành phần độ tinh khiết của protein
Bảng 3. 2: Thơng số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One (tính theo % độ tinh khiết của băng protein).
STT băng Maker Trung Quốc Mẫu
1 13.37838 94.14868 98.021 2 19.20191 2.351318 3 16.52623 4 17.1558 5 11.64706 6 21.09062 7 13.37838 Tổng số 99 96.5 98
Mẫu sau tinh chế IL-2 TQ
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.
KẾT LUẬN
1. Đã biểu hiện thành cơng gene il2 cải biến mới so với trình tự il2 của đề tài pha trƣớc (mất alanine ở đầu N, thay thế Cystein bằng Serine ở vị trí 125). Trình tự amino acid dịch mã từ trình tự gene il2 cải biến giống với trình tự một interleukin thƣơng phẩm trên thế giới đƣợc FDA cơng nhận là Proleukin (Aldesleukin) của hãng Chiron-Mỹ.
2. Tối ƣu đƣợc điều kiện lên men quy mơ bình tam giác ở nhiệt độ biểu hiện 43°C, nồng độ IPTG cảm ứng là 1mM, thời gian thu mẫu là 3 giờ 6 phút. Sau khi tối ƣu, hàm lƣợng IL-2 thu đƣợc cao hơn khi biểu hiện ban đầu 46%.
3. Tiền xử lý và tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC thu đƣợc IL-2 cĩ độ sạch tới 98% (sạch hơn so với mẫu đối chứng là IL-2 của Trung Quốc- chỉ đạt 96,5%).
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả đạt đƣợc tơi xin đƣa ra một số kiến nghị nhƣ sau:
1. Nghiên cứu nâng quy mơ sản xuất IL-2 lên quy mơ cơng nghiệp, tối ƣu lên men quy mơ cơng nghiệp nhằm thu đƣợc lƣợng IL-2 lớn nhất để sản xuất.
2. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 bằng tế bào CTLL2.
3. Sản xuất thử nghiệm các loạt IL-2 tái tổ hợp trên dịng tế bào E. coli đạt tiêu chuẩn của một sản phẩm dạng tiêm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Chấn Hùng N. Hiểu biết hiện nay về bệnh ung thƣ. Y học TP. Hồ Chí Minh. 2005;9(1):115–122.
2. Bùi Hồng Q, Nguyễn Đức L. Tối ƣu hĩa sinh tổng hợp LIPASE từ PICHIA ANOMALA VTCC Y0787 sử dụng ma trận PLACKETT-BURMAN và phƣơng pháp đáp ứng bề mặt - phƣơng án cấu trúc cĩ tâm. 2009. Available at: http://elib.hou.edu.vn/handle/123456789/2758.
Tiếng Anh
3. Amron DM, Moy RL. Stratospheric ozone depletion and its relationship to skin cancer. J Dermatol Surg Oncol. 1991;17(4):370–372.
4. Baba AI, Câtoi C. Comparative Oncology. Bucharest: The Publishing House of
the Romanian Academy; 2007. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9557/.
5. Bhagwat AS, Sohail A, Roberts RJ. Cloning and characterization of the dcm locus of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 1986;166(3):751–755.
6. Biles WE, Swain JJ. Optimization and industrial experimentation. New York: Wiley; 1980.
7. Box GEP, Draper NR. Empirical model-building and response surfaces. New York: Wiley; 1987.
8. Boyle P, Levin B, Cancer IA for R on. World cancer report 2008. IARC Press; 2008.
9. Boyman O, Sprent J. The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2012;12(3):180–190.
10. Cooper GM. Oncogenes. 2000. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9840/
11. Deepak V, Kalishwaralal K, Ramkumarpandian S, et al. Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology. Bioresour. Technol. 2008;99(17):8170–8174.
12. DrugBank ed. Aldesleukin (DB00041). DrugBank. 2012. Available at: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00041
13. Francis DM, Page R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 2010;Chapter 5:Unit 5.24.1–29.
14. Grimm EA. Cytokines: Biology and Applications in Cancer Medicine. 2000. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20931/
15. Grodberg J, Dunn JJ. ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification. J. Bacteriol.
1988;170(3):1245–1253.
16. Haacke A, Fendrich G, Ramage P, Geiser M. Chaperone over-expression in Escherichia coli: apparent increased yields of soluble recombinant protein kinases are due mainly to soluble aggregates. Protein Expr. Purif. 2009;64(2):185–193. 17. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100(1):57–70. 18. Hora MCCC. Preparing aldesleukin for pharmaceutical use. 2006.
19. Kammula US, White DE, Rosenberg SA. Trends in the safety of high dose bolus interleukin-2 administration in patients with metastatic cancer. Cancer. 1998;83(4):797–805.
20. Lee DS, White DE, Hurst R, Rosenberg SA, Yang JC. Patterns of relapse and response to retreatment in patients with metastatic melanoma or renal cell carcinoma who responded to interleukin-2-based immunotherapy. Cancer J Sci Am. 1998;4(2):86–93.
21. Liang SM, Thatcher DR, Liang CM, Allet B. Studies of structure-activity relationships of human interleukin-2. J. Biol. Chem. 1986;261(1):334–337.
22. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Proto-Oncogenes and Tumor-Suppressor Genes. 2000. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21662/
23. MacWilliams MP, Bickle TA. Generation of new DNA binding specificity by truncation of the type IC EcoDXXI hsdS gene. EMBO J. 1996;15(17):4775–4783. 24. Mauro FR, Gentile M, Foa R. Erythropoietin and chronic lymphocytic leukemia. Rev Clin Exp Hematol. 2002;Suppl 1:21–31.
25. Moan J, Dahlback A. The relationship between skin cancers, solar radiation and ozone depletion. Br. J. Cancer. 1992;65(6):916–921.
26. Moffatt BA, Dunn JJ, Studier FW. Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol. 1984;173(2):265–269.
27. Ngoan LT, Lua NT, Hang LTM. Cancer mortality pattern in Viet Nam. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2007;8(4):535–538.
28. Oudard S, George D, Medioni J, Motzer R. Treatment options in renal cell carcinoma: past, present and future. Ann Oncol. 2007;18(suppl 10):x25–x31. Available at: [Accessed October 26, 2013].
30. Regnier FE. High-performance liquid chromatography of biopolymers. Science. 1983;222(4621):245–252.
31. Rishabha Malviya VB. HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY: A SHORT REVIEW. Journal of Global Pharma Technology. 2010;2(5):22–26.
32. Safar M, Junghans RP. Interleukin 2 maintains biologic stability and sterility over prolonged time. Immunopharmacology. 2000;49(3):419–423.
33. Schnaitman CA, Austin EA. Efficient incorporation of galactose into lipopolysaccharide by Escherichia coli K-12 strains with polar galE mutations. J Bacteriol. 1990;172(9):5511–5513.
34. Schwartzentruber DJ. Guidelines for the safe administration of high-dose interleukin-2. J. Immunother. 2001;24(4):287–293.
35. Schwertschlag US, Trepicchio WL, Dykstra KH, et al. Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of interleukin-11. Leukemia. 1999;13(9):1307–1315.
36. Sim M, Seok H-S, Kim J. A Next-generation Sequence Clustering Method for
E. Coli through Proteomics-genomics Data Mapping. Procedia Computer Science. 2013;23:96–101.
37. Stephens FO, Aigner K. Basics of Oncology. Springer; 2009.
38. Thomson AW, Lotze MT. The Cytokine Handbook, Two-Volume Set. Gulf Professional Publishing; 2003.
39. Titov KS, Kiselevskii MV, Demidov LV, et al. Use of recombinant interleukin- 2 for intrapleural therapy of tumor-associated pleurisy. Bull. Exp. Biol. Med.
2009;148(5):794–796.
40. UK CR. Cancer Worldwide - the global picture. 2013. Available at: http://www.cancerresearchuk.org/cancer-info/cancerstats/world/the-global-picture/ 41. Vydac. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-phase HPLC. Vydac; 1995.
42. Weinberg RA. How cancer arises. Sci. Am. 1996;275(3):62–70.
43. Yin J, Li G, Ren X, Herrler G. Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes. J. Biotechnol. 2007;127(3):335–347.
44. Zhang C, Wang B, Wang M. GM-CSF and IL-2 as adjuvant enhance the immune effect of protein vaccine against foot-and-mouth disease. Virol. J.
2011;8:7. Internet 45. http://www.who.int/en/ 46. http://www.cancer.org 47. http://www.uspto.gov/ 48. http://www.fda.gov/
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Lê Phuơng Hồng Anh, Đào Trọng Khoa, Nguyễn Hồng Thanh, Phùng Thu Nguyệt, Trƣơng Nam Hải (2013). Nghiên cứu loại bỏ nội độc tố khỏi sản phẩm interleukin-2 nguời tái tổ hợp bằng phương pháp siêu lọc và sắc ký đảo pha (RP-HPLC). Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 1, 268 – 272.
2. Lê Thị Lan Anh, Lê Phuơng Hồng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hồng, Phùng Thu Nguyệt, Đồn Thị Thủy, Lƣu Anh Chiến, Trƣơng Nam Hải (2013). Nghiên cứu tối ưu biểu hiện gen mã hĩa interleukin-2 nguời trong Escherichia coli. Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 1, 19 – 23.
3. Lê Thi Lan Anh, Lê Phƣơng Hồng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hằng, Phùng
Thu Nguyệt, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Hằng, Trƣơng Nam Hải (2013). Biểu hiện gen
mã hĩa IL-2 của người với chaperon groesl và thioredoxin trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3).Tạp chí Khoa học và Phát triển, Trƣờng Đại học Nơng nghiệp Hà Nội. 11(6), 777-783.