nghiệm Design Expert 7.0.
Trƣớc đây thơng thƣờng để tăng sản lƣợng protein tái tổ hợp các nhà nghiên cứu sử dụng kỹ thuật khảo sát điểm tối ƣu của từng điều kiện. Đây là phƣơng pháp áp dụng cho từng yếu tố ảnh hƣởng đến sản lƣợng, nĩi chung nếu đánh giá với yếu tố riêng rẽ thì kỹ thuật này cho kết quả khả quan, tiến hành đơn giản ít thí nghiệm, tuy nhiên khơng thể đánh giá một cách chính xác ảnh hƣởng của các yếu tố cần tối ƣu với nhau. Nếu muốn tìm ra điểm tối ƣu (giao điểm giá trị của các nhân tố tại đĩ sản lƣợng protein tái tổ hợp cao nhất) thơng thƣờng phải làm rất nhiều thí nghiệm và khi kết hợp các điểm tối ƣu riêng rẽ với nhau thì hiệu quả chƣa phải đã là tốt nhất11[11]. Một phƣơng pháp khác mới (phƣơng pháp đáp ứng bề mặt Respone surface methodology RSM), sử dụng thống kê tốn học kết hợp với tin học7[7] sẽ mơ hình hĩa thí nghiệm, phƣơng pháp này cho phép khảo sát nhanh từng yếu tố cũng nhƣ tìm đƣợc điểm tối ƣu cho thí nghiệm tƣơng đối chính xác với số lƣợng thí nghiệm tiến hành ít hơn rất nhiều so với phƣơng pháp thơng thƣờng, nhờ đĩ giảm chi phí cũng nhƣ cơng sức cho việc thực hiện thí nghiệm đi rất nhiều2[2]. Tuy nhiên muốn mơ hình thí nghiệm cĩ ý nghĩa, và khơng phải lặp lại thí nghiệm nhiều lần thì thí nghiệm tiến hành cần phải rất cẩn thận, khoa học, các phƣơng pháp đo kết quả phải đảm bảo tin cậy và cĩ độ chính xác cao.
Phần mềm Design Expert:
Đây là một phần mềm đƣợc phát triển bởi hãng Stat-Ease (Hoa Kỳ). Là phần mềm tổng hợp sử dụng nhiều thuật tốn và phƣơng pháp quy hoạch khác nhau để thiết kế các thí nghiệm sử dụng trong các ngành khoa học cơ bản nhƣ tốn học, vật lý, hĩa học và sinh học,… Một ƣu điểm của phần mềm này là cĩ thể sử dụng phối hợp các phƣơng pháp để đánh giá và thiết kế thí nghiệm một cách tốt nhất. Phần mềm cũng cung cấp những cơng cụ mạnh mẽ để phân tích kết quả nhƣ cơng cụ ANOVA (sử dụng để phân tích giá trị thực nghiệm, tĩm tắt thống kê: đƣa ra thống kê phƣơng sai, phƣơng trình hồi quy, giúp đánh giá khả năng đúng của lý thuyết với
thực nghiệm,…) cơng cụ DIANOSTICS giúp phân tích và chọn lựa đúng mơ hình và sự phu thuộc của các giá trị theo từng mơ hình, cơng cụ MODEL GRAPHS giúp đánh giá mơ hình một cách trực quan các yếu tố theo dạng biểu đồ hình ảnh,…
Thiết kế tối ƣu phức hợp trung tâm-đáp ứng bề mặt (CCD-RSM).
CCD-RSM là một thiết kế nằm trong phần mềm Design Expert, đƣợc Biles và Swain phát mình vào năm 1980, sau đĩ phát triển dùng để tối ƣu các đại lƣợng biểu thị bằng số dựa trên thống kê và thực nghiệm6[6]. Để thực hiện phƣơng pháp này cần xác định ba đại lƣợng là: thừa số (các yếu tố cần khảo sát, mỗi yếu tố cần xác định 2 mức cao và thấp), điểm trung tâm (là điểm giữa của các đại lƣợng khảo sát) và điểm sao (là giá trị phản hồi của các đại lƣợng số bên trên). Sau khi đã cĩ các đại lƣợng, ma trận đƣợc thiết lập tính tốn sử dụng hồi quy tuyến tính để tìm ra phƣơng trình hồi quy cĩ dạng
Yi=βixi1 + …+ βpxip + εi= xiT β + εi, i= 1,…n,
Trong đề tài này chúng tơi sử dụng phần mềm Design Expert 7 của hãng Stat- Ease, trong đĩ cĩ sử dụng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt-phƣơng án cấu trúc cĩ tâm để thiết kế quy hoạch thực nghiệm nhằm thu đƣợc sản lƣợng IL-2 cực đại từ dịch nuơi cấy tế bào vi khuẩn E. coli BL21 tái tổ hợp ở quy mơ bình tam giác.
Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
2.1.1 Các chủng vi sinh vật, plasmid
Vector tái tổ hợp pET22-IL-2
Chủng vi sinh vật (Invitrogen): chủng biểu hiện E. coli BL21.
2.1.2 Hĩa chất, enzyme, phần mềm.
Thang DNA chuẩn, thang protein chuẩn, (Fermentas); D-glucose, ampicillin Tris-HCl, glycine, SDS (BioRad); phenol, chloroform, methanol, iso- amylalcohol, glycerol, ethanol, Na2CO3, NaHCO3, Na2HPO4, NaH2PO4, KCl, NaCl, K2HPO4, HCl, HSO4, acetic acid (Merck); cao nấm men, bacto- pepton, bacto-tryptone (BD), các hố chất thơng dụng khác (BioLab, BioRad, Merk, Fermentas).
Các enzyme hạn chế, Taq DNA polymerase, T4 DNA ligase, phosphatase kiềm (BioLab và Fermentas). Bộ kit dùng để tinh sạch DNA từ agarose gel (QIAGen).
Phần mềm Quantity One, Design Expert 7.0.
2.1.3 Máy mĩc
Máy ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorvall), máy ly tâm lạnh cỡ nhỏ (Sorvall), box cấy (Sanyo), Máy điện di DNA (Mupid), máy vortex (Rotolab), bộ điện di và máy điện di protein đứng (Bio-rad), máy speedvac AES1010 (Savant), máy lắc ổn nhiệt KS260 basic (IKA), máy PCR PTC-100 Thermal Cycles (MJ Research), bể ổn nhiệt waterbatch (Memmert), máy siêu âm (Microson), máy giải trình tự gene ABI 3100 (ABI), máy xung điện gene pulser II (Bio-rad), máy đo OD (LaboMed), máy khuấy từ (IKA Labotechnik), tủ lạnh 4°C, -20°C, -85°C (Sanyo).
2.2.1 Tách chiết DNA plasmid từ E. coli.
Cơ sở lý thuyết: Dƣới tác dụng của các hĩa chất NaOH, SDS thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, và các phân tử protein, DNA genome bị biến tính. Khi thay đổi giá trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch Kali acetate, các phân tử protein và DNA genome biến tính sẽ kết tủa. Phần protein cịn lại cùng các mảnh vỡ của tế bào sẽ đƣợc kết tủa bằng dung dịch Chloroform : Isoamylalcohol (24:1 v/v) và đƣợc tách ra khỏi phần dung dịch chứa DNA plasmid bằng cách ly tâm ở tốc độ cao. DNA plasmid nẳm ở pha trên đƣợc thu lại bằng cách tủa trong cồn tuyệt đối. RNA cĩ trong dung dịch đƣợc loại bỏ bằng cách bổ sung nƣớc chứa RNase 10 µg/µL.
Các dung dịch cần dùng: Dung dịch I (Glucose 50 mM ; TrisHCl 25 mM pH 8,0; EDTA 10 mM pH 8,0), dung dịch II (NaOH 0,2 N; SDS 1%), dung dịch III (CH3COOK 3 M; CH3COOH 5 M), ethanol 100%, ethanol 70%, chloroform : isoamylalcohol (24:1 v/v) nƣớc chứa RNase 10 mg/mL. Mơi trƣờng LB (Cao nấm men 0,5%, Bacto trypton 1%, NaCl 1%). Mơi trƣờng chọn lọc LBA (LB, bổ sung Ampicillin để đạt nồng độ cuối cùng là 100 μg/mL). Mơi trƣờng LB đặc (LB, bổ sung thêm 1,5% agar). LBA đặc (LB đặc, bổ sung Ampicillin đến nồng độ cuối cùng 100 μg/mL).
Cách tiến hành: Nhặt một khuẩn lạc tế bào E. coli đƣợc chuyển vào 2 mL mơi trƣờng LBA và nuơi cấy lắc với tốc độ 200 v/p ở 37°C qua đêm. Tế bào sau khi nuơi cấy đƣợc thu lại bằng cách ly tâm trong 5 phút với tốc độ 5000 v/p và đƣợc hịa vào 100 L dung dịch I. Mẫu đƣợc làm huyền phù bằng máy vortex và để ở nhiệt độ phịng trong vịng 5 phút. Thêm 200 L dung dịch II pha mới hồn tồn, lắc nhẹ nhàng và đặt trên đá trong khoảng 10 phút. Thêm 150 L dung dịch III lạnh, đảo nhanh và đặt trên đá trong khoảng 5 phút. Lúc này, xác tế bào và DNA genome bị kết tủa lại thành mảng trắng, dễ dàng đƣợc loại bỏ bằng ly tâm với tốc độ 13000 v/p trong 10 phút. Để loại bỏ triệt để các protein bám DNA, dung dịch pha tan đƣợc hịa theo tỷ lệ 1:1 (v/v) với chloroform:isoamyl alcohol (24:1), lắc đều và ly tâm 10 phút với tốc độ 13000 v/p. Dung dịch pha trên đƣợc chuyển sang ống eppendorf
mới. Lặp lại bƣớc loại bỏ protein với 400 L dung dịch hỗn hợp cholorofom : isoamyl alcohol. Sau khi ly tâm, pha trên chứa DNA plasmid đƣợc thu lại. DNA plasmid đƣợc tủa bằng hai lần thể tích cồn tuyệt đối. Mẫu đƣợc giữ ở -20°C trong 2 giờ. DNA plasmid đƣợc thu lại bằng cách ly tâm 13000 v/p trong 10 phút và đƣợc rửa lại bằng cồn 70%. Phần tủa DNA đƣợc làm khơ bằng máy Speed Vac và hịa vào 30 l H2O cĩ chứa RNase ở nồng độ cuối cùng là 0,1 mg/mL. DNA plasmid đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% hoặc đƣợc cất giữ ở -20°C.
2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose.
Cơ sở lý thuyết: Trong mơi trƣờng pH trung tính, DNA mang điện tích âm, do vậy nếu đặt trong điện trƣờng đều thì DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Trên gel agarose, DNA sẽ đƣợc phân tách theo kích thƣớc: DNA cĩ kích thƣớc nhỏ di chuyển nhanh hơn DNA cĩ kích thƣớc lớn. Sau đĩ DNA đem nhuộm với EtBr, các băng DNA bắt màu với thuốc nhuộm sẽ quan sát đƣợc dƣới ánh sáng UV. So sánh với thang chuẩn DNA cĩ thể ƣớc đốn đƣợc khối lƣợng phân tử các băng DNA.
Cách tiến hành: DNA đƣợc bổ sung với loading dye 6X (Fermentas) theo tỷ lệ tƣơng ứng là (5:1), sau đĩ dịch mẫu đƣợc tra vào các giếng trên gel. Đặt bản gel theo đúng chiều dịng điện từ (-) sang (+). Sau khi điện di, bản gel đƣợc nhuộm với EtBr khoảng 10 phút, rồi quan sát băng DNA dƣới ánh sáng đèn UV.
2.2.3 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dịng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21. coli BL21.
Cơ sở lý thuyết: Tế bào vi khuẩn E.coli tái tổ hợp mang gene tổng hợp IL-2 đƣợc nuơi cấy trên mơi trƣờng LBA ở 37°C, 200 v/p. Nhờ cơ chế cảm ứng operon lac bằng hĩa chất IPTG, protein IL-2 đƣợc tổng hợp sau 5 giờ.
Cách tiến hành: Một khuẩn lạc đƣợc nuơi lắc qua đêm trong 2 mL LB cĩ bổ sung Ampicilin đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/mL (LBA). Sau đĩ chuyển 30 µL dịch nuơi cấy sang 100 mL mơi trƣờng LBA lắc trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 37°C
đến khi OD600 đạt khoảng từ 0,6 đến 0,8 thì bắt đầu bổ sung IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1mM để cảm ứng, rồi tiếp tục nuơi lắc ở 37°C. Mẫu đƣợc thu lại sau khi cảm ứng 4 giờ, bằng máy ly tâm ở tốc độ 5000 v/p trong 5 phút.
2.2.4 Phương pháp giải trình tự gene
Thành phần của phản ứng khuyếch đại DNA của phƣơng pháp giải trình tự gồm: 3,2 pM mồi, 200 ng DNA plasmid, BigDye, đệm dùng cho BigDye trong tổng thể tích 20 µL với chu trình nhiệt trên máy PCR nhƣ sau: 96°C-1 phút; 25 chu kỳ (96°C-10 giây, 50°C-10 giây, 60°C-4 phút); bảo quản ở 4°C.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch, kết tủa và làm khơ DNA, bổ sung 10µL Hi-Di Formamid và biến tính ở 95°C trong 5 phút. Các mẫu đƣợc đƣa vào các giếng của khay đựng mẫu sau đĩ điện di bằng máy trong ống vi mao quản 80 cm x 50 µm chứa POP-4 (ABI-Mỹ). Trình tự đọc đƣợc sẽ đƣợc xử lý bằng phần mềm Avant Data Collection v1.0.
2.2.5 Tối ưu hĩa điều kiện lên men bằng phần mềm Design expert 7.0.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng IL-2: Để tối ƣu bằng phần mềm, các yếu tố ảnh hƣởng đến năng suất tạo IL-2 đƣợc khảo sát trƣớc, bao gồm: nhiệt độ lên men, nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian thu mẫu, và OD bắt đầu cảm ứng. Các điều kiện để lên men đƣợc chọn để làm chuẩn là nhiệt độ lên men 37°C, nồng độ IPTG 1 mM, thời gian thu mẫu 5 giờ, OD bắt đầu cảm ứng từ 0,6 đến 0,8. Khi tiến hành khảo sát yếu tố nào thì thay đổi yếu tố đĩ và giữ nguyên giá trị của các yếu tố cịn lại theo điều kiện chuẩn.
Tối ưu điều kiện lên men nhằm thu được sản lượng IL-2 lớn nhất bằng phần mềm chuyên dụng: Sau khi xác định đƣợc các yếu tố chính ảnh hƣởng đến sản lƣợng IL- 2, mơ hình RSM-CCD giúp xác định giá trị tối ƣu và đƣợc nghiên cứu ở 3 mức ( -1, 0, +1, ), trong 15 hoặc 20 thí nghiệm tùy thuộc vào lựa chọn thiết kế. Chọn các điểm tại đĩ sản lƣợng IL-2 sau khảo sát cao nhất làm giá trị trung tâm (giá trị 0),
chọn giá trị thấp nhất và cao nhất của từng yếu tố mà tại đĩ sản lƣợng IL-2 bắt đầu bị ảnh hƣởng làm giá trị tới hạn (-1) và (+1).
Hình 2. 1: Cơng cụ RSM-CCD của phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0
Trong phần mềm design expert 7.0, bƣớc đầu tiên chọn File/New Design. Trong thẻ Respone Curface chọn Central Composite (Hình 2. 1). Trong phần Numberic Factors chọn 3 yếu tố ảnh hƣởng đến sản lƣợng IL-2. Khai tên, giá trị tới hạn (-1 và +1). Chọn kiểu thí nghiệm đầy đủ (20 thí nghiệm) hoặc rút gọn (15 thí nghiệm). Sau khi đã nhập đầy đủ thơng tin phần mềm sẽ cho ra 20 thí nghiệm để tiến hành, kết quả thu đƣợc từ 20 thí nghiệm đĩ đƣợc nhập tiếp tục vào phần kết quả. Từ đĩ sẽ cho ra những điểm tối ƣu mà hàm lƣợng IL-2 đạt giá trị cao nhất.
Cơng việc cuối cùng để hồn thiện tối ƣu là tiến hành thí nghiệm với các điểm tối ƣu đĩ so sánh với 20 thí nghiệm đã tiến hành để kiểm chứng.
2.2.6 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide.
Cơ sở lý thuyết: Điện di là quá trình dịch chuyển của phân tử dƣới tác dụng của điện trƣờng qua các mạng lƣới. Các phân tử cĩ tốc độ di chuyển tùy thuộc vào điện tích, kích thƣớc khối lƣợng, hình dạng phân tử. Protein đƣợc xử lý với SDS là chất mang điện âm cĩ khả năng bám vào protein làm protein tích điện tích âm đồng thời biến tính protein, tạo dạng thành dạng thẳng. Do cùng cĩ điện tích và là dạng thẳng nên protein cĩ tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thƣớc, khối lƣợng.
Các dung dịch cần dùng: Để chế 1 bản gel Acrylamide cần: Bis-Acrylamide 30%, APS 10%, Glyxerol 50%, TEMED. Đệm Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 cho gel tách. Tris- HCl 0,5 M pH 6,8 cho gel cơ. Đệm chạy điện di 6x: 7 mL Tris HCl pH 6,8; 3 mL Glycerol 100%; 1 g SDS; 1,2 mg Bromophenol blue; 0,6 mL 2-mecaptoethanol.
Bảng 2. 1 Cơng thức chế 1 bản gel acrylamide
Thành phần Gel tách (4,5 mL) Gel cơ (1 mL)
H2O 0,55 mL 0,45 mL Tris HCl 1,5M (pH8,8) 1,125 mL - Tris HCl 0,5M (pH6,8) - 0,3 mL Glycerol (50%) 0,9 mL - Bis/acrylamide 1,89 mL 0,14 mL SDS 10% 45µL 4 µL APS 30 µL 8 µL TEMED 3 µL 1 µL
Cách tiến hành: Các tế bào thu lại nhờ ly tâm đƣợc phá bằng đệm xử lý mẫu 6X và ủ ở 100oC trong 10 phút để phá tế bào, tích điện âm cho protein. Lắp bản gel, tra mẫu vào các giếng và chạy với cƣờng độ dịng cố định từ 20-30 mA trong khoảng 45 phút. Gỡ bản gel và đem nhuộm bạc, hoặc nhuộm comassie để xem kết quả. Nhuộm bạc: Gel đƣợc ngâm trong dung dịch cố định (Ethanol 50%, Acid acetic 12%, Formaldehyte 0,05%) lắc với thời gian khoảng 60 phút, sau đĩ rửa 3 lần với H2O 1X trong 20 giây, rửa bằng dung dịch rửa (Ethanol 100%) 2 lần, mỗi lần 20 phút. Sau đĩ cho vào dung dịch làm tăng độ nhạy (Na2S2O3 0,02%) lắc trong 10 phút. Rửa với H2O 1X 2 lần mỗi lần 20 giây. Nhuộm bản gel bằng dung dịch nhuộm bạc (AgNO3 0,2%; Formaldehyte 0,075%) trong 20 phút. Hiện màu các băng protein bằng dung dịch hiện màu (Na2CO3 6%; Na2S2O3 0,0004%, Formaldehyte 0,05%). Dừng phản ứng hiện màu bằng dung dịch dừng phản ứng (Glycine 0,5 g; H2O 50 mL).
Nhuộm comassie: Bản gel đƣợc gỡ ra và đem rửa với dung dịch rửa I (Methanol 10%, Acetic acid 10%) trong 10 phút. Sau đĩ nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm comassie từ 30 đến 60 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc tẩy màu bằng dung dịch rửa II ( Ethanol 35%, Glycerol 2%) cho tới khi sạch nền và các băng quan sát rõ nét.
2.2.7 Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Western Blot.
Cơ sở lý thuyết: Western Blot là phƣơng pháp xác định protein một cách đặc hiệu dựa vào phản ứng kháng nguyên kháng thể. Protein nằm trên gel SDS-PAGE đƣợc chuyển sang màng hấp thụ - Polyvinylidene diflouride (PVDF), sau đĩ protein đƣợc xác định bằng phản ứng giữa kháng thể 1 (kháng thể kháng với Interleukin 2- hãng sigma) và kháng thể 2 (kháng với kháng thể 1-hãng sigma) cĩ gắn với chất chỉ thị màu.
Cách tiến hành: Mẫu đƣợc tiến hành điện di theo phƣơng pháp SDS-PAGE, gỡ bản gel và chuyển màng bằng hệ thống chuyển màng semi-dry. Màng đƣợc ngâm trong methanol từ 5-10 phút. Song song với đĩ giấy thấm đƣợc ngâm trong
Blotting buffer 10 phút. Mở nắp máy và xếp các thành phần theo thứ tự từ dƣới lên trên: giấy thấm-màng PVDF – gel – giấy thấm. Chạy máy với hiệu điện thế 15 V trong 20 phút). Lấy màng ra khỏi hệ thống, phủ màng bằng sữa tách bơ skim milk 5% trong dung dịch TBS ở 4°C trong 1 giờ. Màng đƣợc rửa bằng dung dịch TTBS 3 lần, mỗi lần 10 phút và TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút. Màng sau khi rửa sạch sẽ đƣợc phủ kháng thể 1 và lắc ở nhiệt độ phịng. Sau 1 giờ phủ kháng thể màng tiếp tục