Nhiệt độ (°C) 42 34-50
Nồng độ IPTG (mM) 1 0,5-1,5
Thời gian biểu hiện (giờ) 3 1-5
ng/mL 1310 1218 3147 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 30°C 37°C 42°C Nhiệt độ °C 986 1066 1086 1106 1231 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0,1 mM 0,5 mM 1 mM 1,2 mM 1,5 mM Nồng độ chất cảm ứng IPTG 1617 2488 2764 2026 1218 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 1h 2h 3h 4h 5h
Nhập giá trị đã xác định vào phần mềm nhƣ ở phần phƣơng pháp 2.2.5 (trang 28). Phần mềm sẽ thiết kế 20 thí nghiệm cần thực nghiệm, sau đĩ nhập kết quả vào phần mềm (phần respone) nhƣ ở Hình 3. 5:
Hình 3. 5: Chi tiết thiết kế và hàm lƣợng IL-2 của sau khi thực hiện 20 thí nghiệm. Để đánh giá tƣơng quan giữa kết quả xác định hàm lƣợng bằng ELISA chúng tơi tiến hành điện di SDS-PAGE và nhuộm comassie để kiểm tra protein của 20 thí nghiệm và đối chứng âm (khơng cảm ứng IPTG đƣợc gọi là thí nghiệm số 21). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3. 6: Kết quả tiến hành 20 thí nghiệm đánh giá bằng phƣơng pháp ELISA và điện di SDS– PAGE.
Nhìn trên Hình 3. 6 cĩ thể thấy rằng ở mẫu số 21 (đối chứng âm, khơng cảm ứng IPTG) khơng xuất hiện băng IL-2 cĩ kích thƣớc khoảng 15 kDa, kết quả này tƣơng ứng với hàm lƣợng IL-2 thấp dƣới 1000 ng/mL. Tƣơng tự các thí nghiệm số 1,3,8, 11,12,13 đều cĩ hàm lƣợng IL-2 thấp (thấp hơn 1000 ng/mL) thì ở vị trí 15 kDa các băng nhỏ khơng rõ nét. Trong khi đĩ các thí nghiệm cịn lại cĩ hàm lƣợng IL-2 cao hơn 1000 ng/mL thì cĩ thể nhìn thấy băng khá đậm ở vị trí 15 kDa trùng với vị trí của IL-2 chuẩn (Trung Quốc).
Sau khi tính tốn và phân tích kết quả, phần mềm đƣa ra một số kết quả nhƣ sau: Phƣơng trình hồi quy tuyến tính để tính tốn hàm lƣợng IL-2:
Y=3234.26+224.94*A+482.81*B+174.80*C-6.20*A*B+54.65*A*C+140.10* B*C - 655.89 *A2 -886.59 *B2 +205.86 *C2. (Trong đĩ Y là hàm lƣợng IL-2 (ng/mL); A,B,C lần lƣợt là thời gian cảm ứng (giờ ), nhiệt độ cảm ứng (°C) và nồng độ chất cảm ứng (mM). 0 1000 2000 3000 4000 5000 9 10 11 12 13 14 15 16 0 1000 2000 3000 4000 17 18 19 20 21 0 1000 2000 3000 4000 5000 1 2 3 4 5 6 7 8 IL-2 ng/mL ng/mL ng/mL
Hình 3. 7: Mặt đáp ứng của hàm lƣợng IL-2.
Hệ số xác định R2 tính đƣợc là 0,79 chứng tỏ rằng cĩ 79% số liệu thực nghiệm phù hợp với số liệu tiên đốn bởi mơ hình. Giá trị R2 phải lớn hơn 0,75 thì mơ hình mới cĩ ý nghĩa. Giá trị âm của hệ số R2 dự đốn là 0,3167 chứng tỏ rằng điểm tối ƣu sẽ cho hàm lƣợng IL-2 cao hơn 20 thí nghiệm đã tiến hành, và phù hợp với R2 hiệu chỉnh là 0,5871. Giá trị của tín hiệu gây nhiễu là 7,551; lớn hơn 4 chứng tỏ các thí nghiệm là đầy đủ.
Phần mềm sau khi phân tích kết quả sẽ chọn ra điểm tối ƣu. Vì IPTG là hĩa chất khá đắt tiền nên để giảm thiểu giá thành sản phẩm chúng tơi đƣa ra 2 giải pháp:
Giải pháp thứ nhất là tìm ra điểm mà hàm lƣợng IL-2 đạt đƣợc cao nhất
Giải pháp thứ hai là tìm ra điểm mà hàm lƣợng IL-2 cao nhất trong khoảng IPTG từ 0,5 đến 1 mM.
Cùng với đĩ chúng tơi chọn điều kiện ở điểm trung tâm (Nhiệt độ 42°C, thời gian thu mẫu 3 giờ, nồng độ IPTG 1mM) để lên men cùng làm đối chứng.
Bảng 3. 1: Điều kiện biểu hiện của các giải pháp mà phần mềm đƣa ra nhằm tìm ra điều kiện tối ƣu cho lên men.
Ký hiệu Nhiệt độ(°C) Nồng độ IPTG(mM) Thời gian thu mẫu(giờ) Hàm lƣợng IL-2 (ng/mL) Giải pháp 1 S1 44,8 1,5 3,4 6273,0 Giải pháp 2 S2 43,0 1,0 3,1 5908,1 Đối chứng C 42 1 3 4019,4
Tiến hành làm thêm thí nghiệm xác định các giải pháp đƣa ra bởi phần mềm, chúng tơi biểu hiện 3 điều kiện nhƣ ở Bảng 3. 1, kết quả đƣợc xác định bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE, Western blot và đo hàm lƣợng IL-2 bằng phƣơng pháp ELISA.
Hình 3. 8: Kết quả biểu hiện các dự đốn mà phầm mềm đƣa ra A) Hàm lƣợng IL-2 khi biểu hiện ở các giải pháp;
B) Kết quả kiểm tra IL-2 bằng phƣơng pháp SDS-PAGE và Western blot các giải pháp.
Kết quả ở Hình 3. 8 cho thấy ở cả giải pháp 1 và giải pháp 2 mà phần mềm đƣa ra protein IL-2 đều đƣợc biểu hiện tốt cao hơn so với đối chứng C lần lƣợt là 56% và 46%. Nhƣ vậy nếu muốn sản lƣợng IL-2 thu đƣợc cao nhất thì chủng vi khuẩn tái tổ hợp phải đƣợc lên men theo quy trình ở phần phƣơng pháp 2.2.3 trang
6273 5908 4019 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 S1 S2 C ng/mL (A) (B) IL-2 IL-2
27, với các yếu tố thay đổi nhƣ sau: nhiệt độ khi bắt đầu cảm ứng 44,8°C; nồng độ IPTG là 1,5 mM và thời gian thu mẫu là 3 giờ 24 phút (3,4 giờ).
Vì hàm lƣợng IL-2 của giải pháp 1 chỉ hơn 6,1 % so với giải pháp 2, mà lƣợng IPTG cần dùng ở giải pháp 1 hơn gấp 50% so với giải pháp hai.Chính vì để giúp giảm chi phí sản xuất thì chúng tơi chọn giải pháp với điều kiện nhiệt độ lên men là 43°C, nồng độ IPTG 1 mM, thời gian thu mẫu là 3 giờ 6 phút.
3.4Tinh sạch IL-2 từ dịng tế bào E. coli.
Dịch tế bào sau khi lên men đƣợc thu lại bằng cách ly tâm và đƣa về OD 100 trong đệm Tris HCl 0,1M để chuẩn bị cho bƣớc tinh chế. Quy trình tinh chế IL-2 đƣợc tĩm tắt nhƣ trong sơ đồ sau:
IL-2 ngƣời tái tổ hợp biểu hiện trong vi khuẩn thƣờng tồn tại ở dạng khơng tan (Inclusion body) do vậy trƣớc khi đƣa mẫu lên hệ thống HPLC tiến hành tinh chế, IL-2 thơ trong sinh khối tế bào E. coli phải đƣợc trải qua hai quá trình: Quá trình phá tế bào và quá trình xử lý biến tính IL-2 tái tổ hợp dạng thơ. Qua quá trình tối ƣu phá tế bào, tế bào đƣợc phá với 2 lần siêu âm, đồng thời xử lý protein tổng số trong dung dịch chứa đƣờng sucrose. Quá trình làm tan IL-2 ở dạng inclusion body là nhờ hĩa chất Guanidine 7M và đƣa IL-2 trở về dạng khơng tan bằng cách hạ thấp nồng độ Gnd xuống cịn 4M. Cả hai quá trình trên nhằm loại bỏ tối đa các tạp chất khơng mong muốn khác cĩ trong dung dịch chứa mẫu IL-2 thơ, đồng thời thu đƣợc lƣợng IL-2 nhiều nhất cĩ thể. Phá tế bào vi khuẩn E. coli Xử lý protein thơ Tinh chế bằng hệ thống HPLC Bảo quản mẫu
Hình 3. 9: Kết quả tiền xử lý tinh chế phá tế bào thu dịch thơ IL-2 Đƣờng chạy M: thang protein chuẩn (Fermentas)
Đƣờng chạy (+): IL-2 chuẩn của Trung Quốc
Đƣờng chạy 1: IL-2 sau khi tiền tinh chế phá tế bào thu dịch thơ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đƣờng chạy 2: Protein tổng số của tế bào sản xuất IL-2 trƣớc khi tiền tinh chế. Kết quả trên Hình 3. 9 cho thấy ở đƣơng chạy 1 là IL-2 sau khi tiền tinh chế dịch IL-2 thơ là khá sạch, ít băng ở vị trí ngồi 15 kDa rất nhiều so với đƣờng chạy số 2 là dịch protein tổng số trƣớc khi tiền tinh chế. Nhƣ vậy dịch IL-2 thơ sau khi tiền tinh chế đã cĩ thể đƣợc xử lý đƣa lên cột tinh chế HPLC.
Dịch IL-2 thơ sau khi tiền tinh chế đƣợc đƣa lên cột và tiến hành tinh chế nhƣ ở quy trình 2.2.9 trang 33 của luận văn. Kết quả của quá trình tinh chế đƣợc thể hiện trên sắc ký đồ HPLC Hình 3. 10).
Hình 3. 10: Kết quả tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC A) Sắc ký đồ tinh chế IL-2.
B) Kết quả kiểm tra IL-2 sau khi tiền tinh chế phá tế bào thu dịch thơ (đƣờng chạy 1) và IL-2 sau khi tinh chế (đƣờng chạy 2).
Kết quả trên hình Hình 3. 10 cho thấy sắc ký đồ xuất hiện một đỉnh hẹp, nhọn và cao đƣợc lấy ra đem điện di kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm bạc và xác định đƣợc đĩ là IL-2. Nhìn trên Hình 3. 10B cĩ thể nhận ra IL-2 tồn tại ở trạng thái 1 băng duy nhất, trong khi ở đƣờng chạy 1 là dịch IL-2 sau khi tiền tinh chế cịn khá nhiều băng ở các vị trí khác nhau, chứng tỏ IL-2 ở phân đoạn trên đã đƣợc tinh sạch, khơng xuất hiện bất kỳ băng protein tạp nào khác. Phân đoạn này sau đĩ đƣợc đem đi xác định độ tinh sạch bằng phần mềm chuyên dụng.
3.5Xác định độ sạch của mẫu IL-2 sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One. One.
Sau khi tinh sạch IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, chúng tơi tiến hành kiểm tra độ sạch của sản phẩm bằng phần mềm chuyên dụng Quantity One của Bio-rad. Để kiểm chứng cho phƣơng pháp chúng tơi sử dụng mẫu là IL-2 thơ sau tinh chế và IL-2 của Trung Quốc làm đối chứng dƣơng.
Kết quả ở Hình 3. 11 cho thấy ở mẫu IL-2 của Trung Quốc (TQ), là một sản phẩm sạch đã đƣợc kiểm tra chất lƣợng về độ tinh khiết đạt hơn 95%. Sản phẩm IL-
B A
2 TQ tồn tại 2 băng ở kích thƣớc 15 kDa và một băng cao khoảng 30 kDa, đây là dạng IL-2 kép dimer (kiểm tra bằng western blot bằng kháng thể đặc hiệu IL-2 vẫn phát hiện đƣợc băng này). Do vậy băng protein 30 kDa này vẫn chính là sản phẩm IL-2 và khơng ảnh hƣởng đến độ tinh khiết của sản phẩm. Từ Bảng 3. 2 độ sạch của thang protein chuẩn (fermentas) là 99%, mẫu IL-2 TQ cho tỷ lệ IL-2 đạt 95%, và mẫu IL-2 sau tinh chế của chúng tơi đạt đến 98%. Đây chính là giá trị độ tinh khiết của dịch protein IL-2 sau khi tinh chế. Với kết quả này, sản phẩm IL-2 tinh chế thu đƣợc sẽ tiếp tục xây dựng cơng thức bán thành phẩm và thử hoạt tính trên dịng tế bào đặc hiệu CTLL2 để xác định hoạt tính sinh học mong muốn.
Hình 3. 11: Xác định thành phần độ tinh khiết của protein
Bảng 3. 2: Thơng số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One (tính theo % độ tinh khiết của băng protein).
STT băng Maker Trung Quốc Mẫu
1 13.37838 94.14868 98.021 2 19.20191 2.351318 3 16.52623 4 17.1558 5 11.64706 6 21.09062 7 13.37838 Tổng số 99 96.5 98
Mẫu sau tinh chế IL-2 TQ
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.
KẾT LUẬN
1. Đã biểu hiện thành cơng gene il2 cải biến mới so với trình tự il2 của đề tài pha trƣớc (mất alanine ở đầu N, thay thế Cystein bằng Serine ở vị trí 125). Trình tự amino acid dịch mã từ trình tự gene il2 cải biến giống với trình tự một interleukin thƣơng phẩm trên thế giới đƣợc FDA cơng nhận là Proleukin (Aldesleukin) của hãng Chiron-Mỹ.
2. Tối ƣu đƣợc điều kiện lên men quy mơ bình tam giác ở nhiệt độ biểu hiện 43°C, nồng độ IPTG cảm ứng là 1mM, thời gian thu mẫu là 3 giờ 6 phút. Sau khi tối ƣu, hàm lƣợng IL-2 thu đƣợc cao hơn khi biểu hiện ban đầu 46%.
3. Tiền xử lý và tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC thu đƣợc IL-2 cĩ độ sạch tới 98% (sạch hơn so với mẫu đối chứng là IL-2 của Trung Quốc- chỉ đạt 96,5%).
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả đạt đƣợc tơi xin đƣa ra một số kiến nghị nhƣ sau:
1. Nghiên cứu nâng quy mơ sản xuất IL-2 lên quy mơ cơng nghiệp, tối ƣu lên men quy mơ cơng nghiệp nhằm thu đƣợc lƣợng IL-2 lớn nhất để sản xuất.
2. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 bằng tế bào CTLL2.
3. Sản xuất thử nghiệm các loạt IL-2 tái tổ hợp trên dịng tế bào E. coli đạt tiêu chuẩn của một sản phẩm dạng tiêm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Chấn Hùng N. Hiểu biết hiện nay về bệnh ung thƣ. Y học TP. Hồ Chí Minh. 2005;9(1):115–122.
2. Bùi Hồng Q, Nguyễn Đức L. Tối ƣu hĩa sinh tổng hợp LIPASE từ PICHIA ANOMALA VTCC Y0787 sử dụng ma trận PLACKETT-BURMAN và phƣơng pháp đáp ứng bề mặt - phƣơng án cấu trúc cĩ tâm. 2009. Available at: http://elib.hou.edu.vn/handle/123456789/2758.
Tiếng Anh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Amron DM, Moy RL. Stratospheric ozone depletion and its relationship to skin cancer. J Dermatol Surg Oncol. 1991;17(4):370–372.
4. Baba AI, Câtoi C. Comparative Oncology. Bucharest: The Publishing House of
the Romanian Academy; 2007. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9557/.
5. Bhagwat AS, Sohail A, Roberts RJ. Cloning and characterization of the dcm locus of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 1986;166(3):751–755.
6. Biles WE, Swain JJ. Optimization and industrial experimentation. New York: Wiley; 1980.
7. Box GEP, Draper NR. Empirical model-building and response surfaces. New York: Wiley; 1987.
8. Boyle P, Levin B, Cancer IA for R on. World cancer report 2008. IARC Press; 2008.
9. Boyman O, Sprent J. The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2012;12(3):180–190.
10. Cooper GM. Oncogenes. 2000. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9840/
11. Deepak V, Kalishwaralal K, Ramkumarpandian S, et al. Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology. Bioresour. Technol. 2008;99(17):8170–8174.
12. DrugBank ed. Aldesleukin (DB00041). DrugBank. 2012. Available at: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00041
13. Francis DM, Page R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 2010;Chapter 5:Unit 5.24.1–29.
14. Grimm EA. Cytokines: Biology and Applications in Cancer Medicine. 2000. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20931/
15. Grodberg J, Dunn JJ. ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification. J. Bacteriol.
1988;170(3):1245–1253.
16. Haacke A, Fendrich G, Ramage P, Geiser M. Chaperone over-expression in Escherichia coli: apparent increased yields of soluble recombinant protein kinases are due mainly to soluble aggregates. Protein Expr. Purif. 2009;64(2):185–193. 17. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100(1):57–70. 18. Hora MCCC. Preparing aldesleukin for pharmaceutical use. 2006.
19. Kammula US, White DE, Rosenberg SA. Trends in the safety of high dose bolus interleukin-2 administration in patients with metastatic cancer. Cancer. 1998;83(4):797–805.
20. Lee DS, White DE, Hurst R, Rosenberg SA, Yang JC. Patterns of relapse and response to retreatment in patients with metastatic melanoma or renal cell carcinoma who responded to interleukin-2-based immunotherapy. Cancer J Sci Am. 1998;4(2):86–93.
21. Liang SM, Thatcher DR, Liang CM, Allet B. Studies of structure-activity relationships of human interleukin-2. J. Biol. Chem. 1986;261(1):334–337.
22. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Proto-Oncogenes and Tumor-Suppressor Genes. 2000. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21662/
23. MacWilliams MP, Bickle TA. Generation of new DNA binding specificity by truncation of the type IC EcoDXXI hsdS gene. EMBO J. 1996;15(17):4775–4783. 24. Mauro FR, Gentile M, Foa R. Erythropoietin and chronic lymphocytic leukemia. Rev Clin Exp Hematol. 2002;Suppl 1:21–31.
25. Moan J, Dahlback A. The relationship between skin cancers, solar radiation and ozone depletion. Br. J. Cancer. 1992;65(6):916–921.
26. Moffatt BA, Dunn JJ, Studier FW. Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol. 1984;173(2):265–269.
27. Ngoan LT, Lua NT, Hang LTM. Cancer mortality pattern in Viet Nam. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2007;8(4):535–538.
28. Oudard S, George D, Medioni J, Motzer R. Treatment options in renal cell carcinoma: past, present and future. Ann Oncol. 2007;18(suppl 10):x25–x31. Available at: [Accessed October 26, 2013].
30. Regnier FE. High-performance liquid chromatography of biopolymers. Science. 1983;222(4621):245–252.
31. Rishabha Malviya VB. HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY: A SHORT REVIEW. Journal of Global Pharma Technology. 2010;2(5):22–26. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
32. Safar M, Junghans RP. Interleukin 2 maintains biologic stability and sterility over prolonged time. Immunopharmacology. 2000;49(3):419–423.
33. Schnaitman CA, Austin EA. Efficient incorporation of galactose into lipopolysaccharide by Escherichia coli K-12 strains with polar galE mutations. J Bacteriol. 1990;172(9):5511–5513.
34. Schwartzentruber DJ. Guidelines for the safe administration of high-dose interleukin-2. J. Immunother. 2001;24(4):287–293.
35. Schwertschlag US, Trepicchio WL, Dykstra KH, et al. Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of interleukin-11. Leukemia. 1999;13(9):1307–1315.
36. Sim M, Seok H-S, Kim J. A Next-generation Sequence Clustering Method for
E. Coli through Proteomics-genomics Data Mapping. Procedia Computer Science.