b. Tối ƣu bằng phần mềm
3.4 Tinh sạch IL-2 từ dịng tế bào E.col i
Dịch tế bào sau khi lên men đƣợc thu lại bằng cách ly tâm và đƣa về OD 100 trong đệm Tris HCl 0,1M để chuẩn bị cho bƣớc tinh chế. Quy trình tinh chế IL-2 đƣợc tĩm tắt nhƣ trong sơ đồ sau:
IL-2 ngƣời tái tổ hợp biểu hiện trong vi khuẩn thƣờng tồn tại ở dạng khơng tan (Inclusion body) do vậy trƣớc khi đƣa mẫu lên hệ thống HPLC tiến hành tinh chế, IL-2 thơ trong sinh khối tế bào E. coli phải đƣợc trải qua hai quá trình: Quá trình phá tế bào và quá trình xử lý biến tính IL-2 tái tổ hợp dạng thơ. Qua quá trình tối ƣu phá tế bào, tế bào đƣợc phá với 2 lần siêu âm, đồng thời xử lý protein tổng số trong dung dịch chứa đƣờng sucrose. Quá trình làm tan IL-2 ở dạng inclusion body là nhờ hĩa chất Guanidine 7M và đƣa IL-2 trở về dạng khơng tan bằng cách hạ thấp nồng độ Gnd xuống cịn 4M. Cả hai quá trình trên nhằm loại bỏ tối đa các tạp chất khơng mong muốn khác cĩ trong dung dịch chứa mẫu IL-2 thơ, đồng thời thu đƣợc lƣợng IL-2 nhiều nhất cĩ thể. Phá tế bào vi khuẩn E. coli Xử lý protein thơ Tinh chế bằng hệ thống HPLC Bảo quản mẫu
Hình 3. 9: Kết quả tiền xử lý tinh chế phá tế bào thu dịch thơ IL-2 Đƣờng chạy M: thang protein chuẩn (Fermentas)
Đƣờng chạy (+): IL-2 chuẩn của Trung Quốc
Đƣờng chạy 1: IL-2 sau khi tiền tinh chế phá tế bào thu dịch thơ.
Đƣờng chạy 2: Protein tổng số của tế bào sản xuất IL-2 trƣớc khi tiền tinh chế. Kết quả trên Hình 3. 9 cho thấy ở đƣơng chạy 1 là IL-2 sau khi tiền tinh chế dịch IL-2 thơ là khá sạch, ít băng ở vị trí ngồi 15 kDa rất nhiều so với đƣờng chạy số 2 là dịch protein tổng số trƣớc khi tiền tinh chế. Nhƣ vậy dịch IL-2 thơ sau khi tiền tinh chế đã cĩ thể đƣợc xử lý đƣa lên cột tinh chế HPLC.
Dịch IL-2 thơ sau khi tiền tinh chế đƣợc đƣa lên cột và tiến hành tinh chế nhƣ ở quy trình 2.2.9 trang 33 của luận văn. Kết quả của quá trình tinh chế đƣợc thể hiện trên sắc ký đồ HPLC Hình 3. 10).
Hình 3. 10: Kết quả tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC A) Sắc ký đồ tinh chế IL-2.
B) Kết quả kiểm tra IL-2 sau khi tiền tinh chế phá tế bào thu dịch thơ (đƣờng chạy 1) và IL-2 sau khi tinh chế (đƣờng chạy 2).
Kết quả trên hình Hình 3. 10 cho thấy sắc ký đồ xuất hiện một đỉnh hẹp, nhọn và cao đƣợc lấy ra đem điện di kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm bạc và xác định đƣợc đĩ là IL-2. Nhìn trên Hình 3. 10B cĩ thể nhận ra IL-2 tồn tại ở trạng thái 1 băng duy nhất, trong khi ở đƣờng chạy 1 là dịch IL-2 sau khi tiền tinh chế cịn khá nhiều băng ở các vị trí khác nhau, chứng tỏ IL-2 ở phân đoạn trên đã đƣợc tinh sạch, khơng xuất hiện bất kỳ băng protein tạp nào khác. Phân đoạn này sau đĩ đƣợc đem đi xác định độ tinh sạch bằng phần mềm chuyên dụng.