Cơ sở lý thuyết: Sau khi tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký đảo pha RP-HPLC, mẫu đƣợc điện di bằng phƣơng pháp SDS-PAGE. Độ tinh sạch đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm bạc và phần mềm chuyên dụng Quatity One của hãng BioRad. Yêu cầu của sản phẩm là phải cĩ độ tinh khiết trên 95%.
Cách tiến hành: Sau khi điện di, lấy bản gel ra nhuộm comassie, rửa sạch bản gel để tránh sai số khi sử dụng phần mềm. Quét ảnh bằng hệ thống soi ảnh của BioRad, hoặc chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số chuyên nghiệp Canon. Nhập ảnh vào máy tính, sử dụng phần mềm Photoshop chuyển từ định dạng gốc sang định dạng .tif. Mở kết quả ảnh bằng phần mềm Quantity One bản quyền. Xác định các đƣờng chạy trên ảnh gel điện di bằng cơng cụ Lane frames. Chỉnh các cột vào chính giữa đƣờng chạy. Trên đƣờng chạy, xác định vị trí các băng bằng cơng cụ Add bands. Chú ý, mỗi băng protein vừa đƣợc chọn nên xác định bao trọn tồn bộ băng để tránh sai số. Tiếp theo xác định đƣờng nền cho phổ hấp phụ qua hai chức năng Sub-background và Lane background. Nháy chuột vào nút cơng cụ band in lane để truy suất kết quả dạng phổ hấp phụ của protein. Sử dụng chức năng Bands attributes để tính tốn mức hấp phụ trên mỗi thang protein. Kết quả đƣợc truy suất bởi cơng cụ Report.
2.2.11 Phương pháp xác định hàm lượng IL-2 bằng ELISA.
Cơ sở lý thuyết:Dựa vào nguyên lý miễn dịch bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể, chúng tơi đánh giá hàm lƣợng IL-2 trƣớc và sau tinh chế trên đĩa ELISA nhờ kháng thể 1 kháng với IL-2 và kháng thể 2 kháng với kháng thể 1, mang cấu trúc thủy phân cơ chất cĩ thể phát hiện bằng máy ELISA ở bƣớc sĩng 450 nm. Đây là phƣơng pháp khá nhạy và chính xác nếu cĩ IL-2 chuẩn đã biết hàm lƣợng.
Các dung dịch cần dùng: dung dịch PBS (NaCl 8g; KCl 0,2 g; Na2HPO4 1,15 g; KH2PO4 0,2 g; dH2O pha tới 1 L). Coating buffer: (NaHCO3 0,05 M; Na2CO3 0,05M). Wash solution (PBS 1L; Tween-20 0,05%). Blocking solution (BSA 1% pha trong PBS). Antibody diluent 1 (BSA 1%; Tween-20 0,05%; Cold fish gelatin
0,1% pha trong PBS). Antibody diluent 2 (Tween-20 0,05%, pha trong PBS). Acetate buffer 5x (CH3COONa 1 M; CH3COOH 0,04 M; pha trong dH2O). TMB 100X (0,01 g; DMSO 1mL; pha trong dH2O đến 1L). Dung dịch cơ chất (Acetate buffer 5x 2mL; TMB 100X 100µL; H2O2 30% 25µL; pha trong dH2O đến 1L).
Cách tiến hành: Phủ kháng nguyên trên đĩa: Pha lỗng kháng nguyên (mẫu cần đo) trong Coating buffer bổ sung 100 µL dịch pha lỗng vào mỗi giếng. Ủ đĩa khoảng 8-10 giờ ở 4°C. Loại Coating buffer và rửa mỗi giếng bằng 200 µL Wash Solution 3 lần. Khĩa dung dịch: Thêm 200 µL Blocking Solution vào mỗi giếng. Ủ 30 phút, sau đĩ loại bỏ dịch và rửa bằng 200 µL Wash Solution 3 lần. Phủ kháng thể 1: pha lỗng kháng thể đơn dịng kháng đặc hiệu IL-2 trong dịch pha lỗng kháng thể 1 (Antibody Diluents) với tỷ lệ tƣơng ứng là 1:5000. Bổ sung 100 µL dịch vừa chuẩn bị vào mỗi giếng. Ủ trong 60 phút rồi loại bỏ dịch bằng 200 µL Wash Solution 3 lần. Phủ kháng thể 2: Pha lỗng kháng thể kháng chuột gắn HRP trong dịch pha lỗng kháng thể 2 (Antibody Diluents 2) với tỷ lệ tƣơng ứng là 1:5000, bổ sung 100 µL dung dịch vừa chuẩn bị vào mỗi giếng. Ủ 60 phút, sau đĩ bổ sung 200 µL Wash solution để rửa 3 lần. Hiện màu bằng phản ứng enzyme cơ chất: Chuẩn bị dung dịch cơ chất (Acetate buffer 5x; TMB 100X, H2O2). Bổ sung 100 µL vào mỗi giếng. Ủ trong 30 phút rồi bổ sung 100 µL H2SO4 nồng độ 2 M vào mỗi giếng để dừng phản ứng. Cuối cùng sử dụng máy đọc ELISA chuyên dụng đo ở bƣớc sĩng 450 nm.
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nhằm làm tăng hoạt tính và giảm tính độc cho sản phẩm IL-2, chúng tơi đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm tạo đột biến mất amino acid Alanine ở đầu N, thay thế Cysteine ở vị trí 125 bằng Serine. Trình tự amino acid suy diễn từ trình tự DNA mã hĩa cho IL-2 giống hồn tồn so với trình tự amino acid của một sản phẩm IL-2 tái tổ hợp đã đƣợc FDA cơng nhận cấp phép và đã đƣợc sử dụng cho các bệnh nhân ung thƣ tế bào thận và ung thƣ ác tính. Đoạn gene này sau đĩ đƣợc tách dịng trong vector pET22b+ tạo thành vector tái tổ hợp dùng để biểu hiện trong E. coli BL21. Vector tái tổ hợp pET22-IL-2 sau đĩ đƣợc gửi đi giải trình tự để kiểm tra xem vector thu đƣợc cĩ mang đúng đoạn gene cần biểu hiện hay khơng. Là một sản phẩm cĩ thể sản xuất và tiêu thụ ra thị trƣờng, vì vậy làm sao để thu đƣợc lƣợng IL- 2 lớn nhất, đƣợc tinh sạch với chi phí thấp là mục tiêu của để tài. Chúng tơi sử dụng phần mềm thiết kế thí nghiệm chuyên dụng là Design Expert 7.0 của hãng Stat Ease nhằm thực hiện đƣợc mục tiêu tối ƣu các điều kiện thu lƣợng lớn IL-2 tái tổ hợp ở quy mơ bình tam giác.
Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:
Biểu hiện gene il2 cải biến mất alanine ở đầu N, thay thế Cystein bằng Serine ở vị trí 125.
Tối ƣu điều kiện lên men nhằm thu đƣợc lƣợng IL-2 cao nhất Tiền xử lý và tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC.
Các kết quả chi tiết trong quá trình thực hiện đề tài đƣợc trình bày chi tiết ở các phần dƣới đây: