QUY PHẠM SẢN XUẤT – GMP • Vaccine cúm A/H5N1. • GMP 3. • Trứng gà có phôi. 1.QUY TRÌNH (Processing)
Lô trứng để nuôi cấy virus : Specific Pathogenic Free - SPF, tạm gọi là trứng siêu sạch được gửi từ Đức.
2.GIẢI THÍCH / LÝ DO (Explaining).
Trứng siêu sạch là trứng không bị bệnh, phôi phát triển tốt.Qúa trình sản xuất trứng gà siêu sạch phải tiến hành trong các điều kiện sản xuất tốt và kiểm soát chặt chẽ, trứng gà siêu sạch khác với các loại trứng thông thường khác ngaoì về chất lượng tốt hơn mà còn có khả năng chống chịu được sự xâm nhập được của các loại vi sinh vật trong một khoảng giới hạn nhất định.
3.CÁC THỦ TỤC CẦN TUÂN THỦ (Producedure)
Gây nhiễm vào trứng gà SPF để tạo các lô giống cho sản xuất thì đòi hỏi trứng gà SPF phải được khử trùng vỏ ngoài bằng Chloramin 0,1 %, ấp trong tủ ấm ở 38,5 oC và độ ẩm 65%.Sau 9 ngày soi trứng để loại bỏ những quả chết và không phát triển thành
phôi.Đánh dấu túi hơi và vị trí phôi để tiến hành tiêm chủng NIBRG-14 vào.
Tiếp tục ủ trứng ở 33,5 oC có độ ẩm 65 %.Sau 24h và 48h soi trứng để loại bỏ những quả chết.Sau 72h trứng chuyển sang tủ lạnh 4oC và để qua đêm.
Yêu cầu của môi trường nuôi chủng NIBRG-14 là phải giàu dinh dưỡng để chúng có thể kích thích phát triển trong các thử nghiệm mô phỏng trong điều kiện vô trùng, chắc chắn mọi thao tác phải giảm được mức độ nhiễm trùng .
Trước khi tiếp xúc với Chloramin thì trứng phải được đưa vào một phòng hay 1 tủ ấm có nhiệt độ và độ ẩm thích hợp (như đã nêu) theo yêu cầu của quy trình.Thời gian quy định giai đoạn này cần được cân đối để giảm thiểu thời gian trước khi khử trùng. Chất khử trùng phải không làm ảnh hưởng đến đến chất lượng sản phẩm, cũng như các điều kiện, thời gian cho phép để khử trùng cần phải được nêu rõ trong tiêu chuẩn kỹ thuật.
Đối với mỗi chu trình khử trùng, cần thực hiện việc ghi chép thời gian tiến hành, nhiệt độ, độ ẩm.Sau khi tiến hành khử trùng, các dụng cụ phải được bảo quản theo phương pháp kiểm soát được điều kiện thông khí để các khí tồn dư và phản ứng của sản phẩm thoát ra tới mức độ quy định.
4.PHÂN CÔNG TRÁCH NHIỆM VÀ BIỂU MẪU GIÁM SÁT. (Responsibility and supervise) (Responsibility and supervise)
Các nhân viên phòng khử trùng và nuôi cấy vi sinh vật.
Ngày tháng năm
(Người phê duyệt)
Số 9 Trần Phú, Nha Trang.QUY PHẠM SẢN XUẤT – GMP QUY PHẠM SẢN XUẤT – GMP • Vaccine cúm A/H5N1. • GMP 4. • Thu gặt. 1.QUY TRÌNH (Processing)
Sau khi chuyển trứng vào buồng lạnh (4oC) để qua đêm.Ngày hôm sau thu hoạch dịch niệu nang qua hệ thống bơm chân không hoặc bơm nhu động.
2.GIẢI THÍCH / LÝ DO (Explaining).
Dùng thiết bị bơm chân không để hút dịch niệu nang có chứa một số lượng lớn virus NIBRG-14 được nhân lên.
3.CÁC THỦ TỤC CẦN TUÂN THỦ (Producedure)
Thiết bị sử dụng để hút dịch niệu nang đòi hỏi phải được làm sạch và khử trùng trước khi quá trình bảo dưỡng được thực hiện.
Người thao tác phải thực hiện đúng quy phạm vệ sinh đã trình bày ở trên.
Cần làm sạch bề mặt trứng trước khi hút, và làm sạch khu vực tiến hành hút trước khi tiến hành.
Người thực hiện phải hiểu rõ cách sử dụng thiết bị bơm chân không hoặc bơm nhu động và thao tác khéo léo trong tủ cấy vô trùng.
4.PHÂN CÔNG TRÁCH NHIỆM VÀ BIỂU MẪU GIÁM SÁT. (Responsibility and supervise) (Responsibility and supervise)
Nhân viên tiến hành thao tác và sử dụng thiết bị bơm chân không.
Ngày tháng năm
(Người phê duyệt)
Số 9 Trần Phú, Nha Trang.QUY PHẠM SẢN XUẤT – GMP QUY PHẠM SẢN XUẤT – GMP • Vaccine cúm A/H5N1. • GMP 5. • Dịch niệu nang. 1.QUY TRÌNH (Processing)
Thu hoạch dịch niệu nang bằng bơm chân không từ mỗi quả trứng riêng rẽ và xác định khả năng khả năng nhân lên của virus trong mỗi quả trứng bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu.
2.GIẢI THÍCH / LÝ DO (Explaining). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dịch niệu nang được thu nhận và là bước cuối cùng trong quy trình tạo chủng giống sản xuất.
Dịch niệu nang có hiệu giá 1/160 HAU và đạt yêu cầu về vô trùng được hỗn hợp lại.Xác định lại hiệu giá HA và vô trùng từng lô.Các lô có hiệu giá HA > 1/160 HAU và đạt vô trùng được chia ra các ống chuyên dụng (dung tích 2ml/ống), mỗi ống 0.5ml giống và bảo quản ở -80oC.Tuy nhiên, cần phải trải qua quá trình tinh sạch, cô đặc thì mới có thể đóng ống bảo quản được.
Đông khô trong dung dịch gelatin 5% với tỷ lệ 1:9 để có nồng độ cuối cùng của gelatin 0,5%.Phân chia vào các ống đông khô mỗi ống 0,5ml, để lạnh sâu -80oCqua đêm sau đó cho vào máy đông khô 24h.Sau khi đông khô ống được hàn kín trong chân không và bảo quản ở -20oC.
Tính ổn định của giống được kiểm tra 3 tháng/1 lần bằng cách cấy vào phôi gà 10 ngày tuổi 3 độ pha 10-1, 10-2, 10-3 để xác định HA.Chủng được xác định tính ổn định về mặt di truyền so với giống gốc.
3.CÁC THỦ TỤC CẦN TUÂN THỦ (Producedure) Giống sản xuất cần được kiểm tra các tiêu chuẩn sau:
• Vô trùng.
• Liều gây nhiễm EID50 .
• Hiệu giá HA của giống sản xuất.
• Tính ổn định về mặt di truyền của giống sản xuất so với giống gốc.
• Điều kiện thời gian bảo quản tối ưu cho hệ giống sản xuất.
Kiểm tra độ vô trùng bằng cách thử cấy trực tiếp trên 2 loại môi trường Thioglycolate và TSB.Yêu cầu không có sự phát triển của vi sinh vật.
Quá trình thu dịch được tiến hành trong điều kiện vô trùng và kiểm tra HA.
Các quy tắc thẩm định về hiệu giá HA thu được sẽ được tiến hành qua các bước tiến hành sau:
Dung dịch virus các cấp độ pha loãng bậc 2 của mẫu thử được tiến hành trên phiến
chuẩn độ 96 giếng đáy tròn hay đáy chữ V.Sau đó cho hồng cầu gà 0,5% trong PBS 7,2.Lắc nhẹ, sau đó để yên trong 1h, đọc kết quả.Nếu phản ứng dương tính hồng cầu bị
ngưng kết thì thành hình dù.Nếu phản ứng âm tính hồng cầu bị lắng xuống thành chấm nhỏ ở đáy giếng.Hiệu giá HA được tính ở độ pha loãng cao nhất còn cho phản ứng dương tính.Đơn vị HAU được tính bằng đảo ngược của hiệu giá HA.
Phản ứng miễn dịch khuyếch tán vòng đơn (phản ứng SRID) xác định nồng độ kháng nguyên ngưng kết hồng cầu
Phản ứng dùng để xác định hàm lượng HA theo mẫu chuẩn quốc tế.Các bước tiến hành như sau:
- Pha huyết thanh kháng HA trong agarose 1%. - Đổ trên phiến kính 120 mm X 120 mm.
- Để thạch nguội, đục các giếng trên thạch đường kính 4 mm /giếng. - Kháng nguyên chuẩn và mẫu thử được xử lý với Zwittergent 10%
trong 30 phút theo tỷ lệ 1/10.
- Cho vào các giếng 20 µl mẫu thử hoặc kháng nguyên chuẩn. - Đặt tấm kính vào buồng ẩm ở 25oC trong 48-72h.
- Nhuộm màu bằng dung dịch Xanh Commassi 0,3% trong 1h.
→ Kết quả được tính bằng đo đường kính vòng ngưng kết so sánh với đường kính của kháng nguyên chuẩn.
Chuẩn độ hiệu giá virus
Pha loãng chủng trong dung dịch PBS thành các độ pha từ 10-3 đến 10-8.Mỗi độ pha tiêm vào khoang vào khoang niệu của trứng gà có phôi 10 ngày tuổi.Mỗi trứng 0,2ml.Sau khi tiêm, trứng được hàn kín bằng parafin nấu chảy và ấp tiếp trong tủ ấm 33,5oC có độ ẩm 60-70%.Sau 24h và 48h trứng được soi để loại bỏ những quả bị chết.Sau 72h trứng được chuyển sang tủ lạnh để qua đêm.Thu hoạch dịch niệu từ mỗi quả trứng riêng rẽ và xác định khả năng nhân lên của virus trong mỗi quả trứng bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu.Hiệu giá virus được xác định bằng phương pháp Reed-muench.
Xác định protein tổng số bằng phương pháp Micro-Kijeldahl.Tiêu chuẩn yêu cầu
≤ 100µg/liều vaccine.
Xác định tính ổn định di truyền của giống sản xuất so với giống gốc:
• Kiểm tra trình tự của các gen (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tách chiết ARN tổng
Khuyếch đại gen HA và NA bằng RT-PCR Tạo dòng sản phẩm PCR
Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.coli chủng INVαF’ Tách chiết ADN plasmid
Tinh sạch plasmid tái tổ hợp Xác định trình tự gen bằng máy tự động
Giống sản xuất được bảo quản ở 2 dạng: đông khô và đông băng.Để xác định thời gian bảo quản, cứ 3 tháng kiểm tra giống một lần nhưu đã nêu trong quy trình tạo giống sản xuất.
4.PHÂN CÔNG TRÁCH NHIỆM VÀ BIỂU MẪU GIÁM SÁT. (Responsibility and supervise) (Responsibility and supervise)
Nhân viên phòng thí nghiệm và nhân viên phòng kiểm định chất lượng.
Ngày tháng năm
(Người phê duyệt)
VIỆN VACCINE NHA TRANG.Số 9 Trần Phú, Nha Trang. Số 9 Trần Phú, Nha Trang. QUY PHẠM SẢN XUẤT – GMP
• Vaccine cúm A/H5N1.
• GMP 6 .
• Tinh sạch, thu sản phẩm giai đoạn 1 và ly tâm