VI. Chế thư viện DNA bổ sung (cDNA library)
4. Sàng lọc thư viện cDNA trong λgt 10 nhờ mẫu dò DNA tổng hợp
4.1. Lựa chọn mẫu dò
Mẫu dò là phương tiện để nhận biết sản phẩm cần có (sản phẩm đích). Nếu trình tự amino acid của protein đã biết là khá dài (hoặc đã biết toàn bộ) thì chọn những đoạn giàu Met, Trp rồi sau đó là Tyr, Cys, His, Glu, Gln, Asn, Asp, Lys, Phe và Arg. Khi không tìm thấy đoạn có codon một nghĩa thì có thể chọn tất cả mọi khả năng có thể có của trình tự nucleotide suy diễn để tổng hợp mồi oligonucleotide, hoặc là chỉ chọn những codon có tần suất xuất hiện cao (ứng với loài sinh vật) để quyết định chọn trình tự nucleotide mồi cần tổng hợp. Cũng có thể lấy base thứ ba của các codon là inosinic acid.
Có thể tổng hợp mẫu dò dựa theo trình tự nucleotide của codon nhưng với Northern hybridization thì cần tổng hợp mẫu dò theo trình tự bổ sung. Độ dài của mẫu dò nên vượt quá 16 base.
Tốt hơn là nên tổng hợp cả hai mẫu dò theo trình tự amino acid của vùng gần đầu amino (-NH2) lẫn đầu carboxyl (-COOH), nếu có thể.
4.2. Đánh dấu mẫu dò
Mẫu dò có thể đánh dấu phóng xạ như trình bày dưới đây hoặc phương pháp phi phóng xạ gắn DIG-dUTP (tham khảo mục 5. Chương 2). 1) Hòa khoảng 50 µg DNA mẫu dò, 5 µl dung dịch đệm phosphate hóa 5×
và [32P]ATP 30 - 50 μCi. Thêm nước cất cho đủ 50 µl, ủ ở 37 °C trong 1 - 2 giờ.
Dung dịch đệm phosphate hóa (5× chứa Tris-HCl (pH
7,6) 0,66M, ATP 10mM, spermidine 10mM, MgCl2 100mM và DTT 150mM.
men...) chiết xuất bằng phenol-chloroform rồi lọc qua cột Sephadex G-25.
4.3. Nhiễm phage vào vi khuẩn E. coli và cấy trải đĩa
1) Hòa vào dung dịch phage thư viện (library phage) λgt 10 chứa 2 - 5×104 pfu, 400 µl SM và 400 µl E. coli đã cấy qua đêm, ủ 15 phút ở 37 °C, sau đó thêm vào 9 ml NZYME-agarose 0,7% (đã hấp cao áp tiệt trùng và ủ ở 50 °C) rồi trải đều lên mặt đĩa môi trường NZYME-agarose 1,5%.
2) Ủ ở 37 °C qua đêm (khoảng 12 - 16 giờ, không ủ quá lâu làm plaque quá to).
4.4. Cố định DNA lên màng
1) Khi thấy plaque thì làm lạnh các đĩa môi trường ở 4 °C (khoảng 30 phút), sau đó đặt lên bề mặt môi trường đĩa một tấm màng nitrocellulose (Milipore, S & S... hoặc màng nylon) đã đánh số (bằng bút bi) tương ứng với số đánh trên đĩa một cách nhẹ nhàng sao cho không khí không còn sót dưới màng để các plaque tiếp xúc tốt với bề mặt màng. Để yên 3 phút. 2) Dùng kim tiêm đánh dấu vị trí của màng so với mặt đĩa (Chọc thủng xuyên cả màng lẫn agarose).
3) Lấy màng ra làm khô tự nhiên (khoảng 5 - 7 phút).
4) Đặt màng (sao cho các plaque hướng lên trên) lần lượt ở trên các lớp giấy thấm đã ngấm đều các dung dịch sau: 1) NaOH 0,5M và NaCl 1,5M trong khoảng 30 - 60 giây, 2) Tris-HCl (pH 7,5) 0,5M và NaCl 1,5M trong 3 - 5 phút, và 3) SSC 2× trong 3 - 5 phút. Do sau khi xử lý dung dịch thứ nhất (trên giấy thấm) tế bào đã phân giải và DNA biến tính đã cố định khá tốt lên màng nên các dung dịch thứ hai và thứ ba có thể xử lý trực tiếp bằng cách đặt màng vào một khay nhỏ có sẵn lượng nhỏ của một trong hai dung dịch đó.
5) Làm khô ở 80 °C trong 1 - 2 giờ. Có thể làm khô một đêm ở nhiệt độ phòng hoặc 60 °C nhưng nên làm khô càng nhanh càng tốt để tránh DNA một sợi phân giải dần trong quá trình làm khô.
4.5. Hybridization
1) Ngâm màng nitrocellulose trong dung dịch SSC 6× rồi ngâm sang dung dịch SSC 6×-Denhardt 1×-SDS 0,5%, lai tiền khởi (prehybridize) ở nhiệt độ ủ thích hợp với độ dài của mẫu dò. Nếu mẫu dò dài 17 base cần ủ ở khoảng 37 ºC, 20 base thì 37 - 42 ºC, 56 base thì khoảng 50 ºC, mẫu dò dài hơn có thể ủ ở 65 ºC.
2) Thực hiện hybridization trong túi chất dẻo. Cho màng vào giữa hai lớp của một mảnh màng polyethylene đã hàn (bằng kẹp nhiệt) một cạnh bên, sau đó hàn tiếp cạnh bên còn lại rồi cho vào đó dung dịch lai. Với màng lọc đường kính 15 cm cần cho vào túi 0,3 - 0,4 ml dung dịch lai. Sau khi cho màng và dịch vào túi thì hàn kín mép còn lại (lưu ý khi hàn: càng ít không khí sót lại càng tốt).
Dung dịch lai (hybridization solution) chứa Tris-HCl (pH
8,0) 50mM, EDTA 10mM, SDS 0,1%, khoảng 2×105 cpm/ml probe và 50 µg/ml RNA nấm men.
3) Ủ ở nhiệt độ thích hợp với độ dài của mẫu dò (như nêu ở trên). Có thể lắc đảo túi lai (để trong ống Corning... hoặc trong khay) trên máy trộn đảo. Thực hiện lai trong khoảng 15 giờ.
4) Đồng thời, trong một túi khác cần thực hiện lai âm tính để kiểm tra phóng xạ nền: Ngâm một màng tương tự nhưng chưa gắn plaque vào dung dịch lai.
4.6. Rửa và tự ký phóng xạ
1) Lấy màng lai và màng kiểm tra phóng xạ nền ra khỏi túi rồi rửa (riêng nhưng cùng chế độ) trong khoảng 50 - 100 ml dung dịch chứa SSC 6× và SDS 0,1%. Nâng dần nhiệt độ cao hơn nhiệt độ lai mỗi lần 2 ºC, đồng thời kiểm tra phóng xạ màng nền cho đến bao giờ hết phóng xạ thì dừng lại. Như vậy chắc chắn không còn tồn dư các probe không đặc hiệu trên các màng.
2) Làm khô tự nhiên hoặc khô nhanh ở 80 °C có quạt gió trong 1 - 2 giờ. Đặt lên màng một tấm film X-quang (trong buồng tối) khoảng 5 giờ đến 1 đêm (ở −80 °C thì tốt, nhưng có thể ở 4 ºC). Sau đó rửa film để hiển thị. Khi được film nào thì phải ghi số tương ứng với số của màng đã tự ký.
4.7. Sàng lọc lại
1) Nếu thấy có film có vệt đen tương ứng với plaque là có plaque dương tính cần tìm. Tìm lại màng đã có kết quả dương tính và dùng vị trí đâm kim trước đây để kiểm tra vị trí của plaque đó trên mặt môi trường agarose.
2) Dùng que tăm đã tiệt trùng lấy lớp agarose mềm cạnh plaque dương tính rồi hòa vào 1 ml SM.
3) Pha huyền dịch trên (~100 lần), trộn 10 µl dịch này với 300 µl lứa cấy
NZYM (thạch phủ mặt, nồng độ agarose khoảng 0,3 - 0,5%, tan ở 50 ºC) rồi láng lên bề mặt môi trường 1,5% agarose-NZYM, để thạch phủ mặt cứng thì ủ ở 37 °C qua đêm.
4) Thực hiện lại các thao tác sàng lọc (screening) như đã mô tả đối với sàng lọc, ở trên.
Chú ý: Nếu sử dụng phương pháp DIG-dUTP để đánh dấu mồi thì sau khi cố định DNA lên màng các bước lai (1) và phát hiện (2) clone đích được tiến hành theo sơ đồ sau:
(1)
(2)
1) Với phương pháp dùng chai lai, đặt màng khô đã gắn DNA vào một chai hybridization bằng thủy tinh (glass hybridization bottle, hãng HyBaid...), sao cho mặt màng có gắn DNA không tiếp xúc với mặt thủy tinh.
2) Rót 10 ml Dig Easy Hyb solution vào một ống li tâm bằng nhựa 15 ml rồi rót dung dịch này vào chai hybridization. Giữ chai nhựa lại sẽ dùng lần nữa.
3) Đậy kín nắp chai hybridization và đặt nó vào lò lai (hybridization oven, hãng BioRad, HyBaid...). Cho quay nhẹ (~5 v/ph) trong 1 - 3 giờ ở 41 oC để ủ đều.
4) Khoảng 10 phút trước khi kết thúc quá trình lai tiền khởi nêu trên, cần chuẩn bị dò: rót 10 ml dung dịch dò, chẳng hạn Dig Easy Hyb (hãng Roche Molecular Biochemicals) vào chai nhựa li tâm nêu ở mục trên. Thêm dò để có nồng độ khoảng 20 - 25 ng/ml. Nắp kín nắp chai nhựa rồi đặt vào trong bể ủ 80 oC trong khoảng 30 phút để biến tính DNA.
5) Sau khi lai tiền khởi kết thúc, lấy chai hybridization ra khỏi lò lai và rót Ủ trong
Washing buffer Blocking bufferỦ trong kháng thểỦ với Washing bufferỦ trong
Ủ trong Detecting buffer Xử lý bằng CPD-Star Phát hiện tín hiệu Lai tiền
khởi Chuẩn bị dò Lai dung dịch Rửa trong I
Rửa trong dung dịch II
bỏ hết dung dịch lai tiền khởi (dung dịch này có thể cất giữ lại để dùng lần sau).
6) Thêm dò đã biến tính (nêu trên: Dig Easy Hyb) vào chai hybridization, lắp vào lò lai và để quay chậm ở 41 oC qua đêm.
7) Rót bỏ dung dịch lai vào chai nhựa 15 ml (cất ở −20 oC khi cần dùng lại thì giải đông, tái sử dụng được 3 - 4 lần nữa).
8) Thêm 20 ml dung dịch rửa (washing solution) I vào chai lai, vặn nắp kín, lắp vào lò lai và cho quay với tốc độ tối đa trong 15 phút (nhiệt độ phòng) để rửa.
9) Rót bỏ hết dung dịch rửa I bằng cách dốc ngược chai lên tờ giấy thấm. Lặp lại bước rửa một lần nữa.
10) Thêm 20 ml dung dịch rửa II ấm ở 62 oC, lắp vào lò lai đã đặt nhiệt độ 62 oC vào quay chậm 15 - 20 phút.
11) Rót bỏ dung dịch rửa II, làm hết dung dịch nhờ giấy thấm hoặc khăn giấy. Lặp lại rửa bằng dung dịch rửa II một lần nữa.
12) Rót bỏ dung dịch rửa II, làm hết dung dịch bằng cách đốc ngược lên một khăn giấy.
12) Thêm 20 ml dung dịch đệm rửa (washing buffer - buffer A). Lắp vào lò lai ở nhiệt độ phòng và quay với tốc độ tối đa 2 - 5 phút.
13) Rót bỏ buffer A, rồi thêm 10 ml dung dịch đệm phong bế (blocking buffer - buffer B). Lắp vào lò cho quay chậm ở nhiệt độ phòng trong 1 - 3 giờ.
15) Rót bỏ hết dung dịch B (vứt bỏ). Dốc miệng chai lai lên giấy thấm để loại bỏ hết dịch.
16) Rót 10 ml dung dịch đệm B (buffer B) vào một chai nhựa 15 ml rồi thêm vào đó 2 μl dung dịch tồn trữ kháng thể chống DIG gắn phosphatase kiềm (anti-DIG-alkaline phosphatase stock solution). Trộn đều và rót vào chai lai có màng. Nắp chai lai và lắp vào lò lai rồi cho quay với tốc độ chậm 30 phút ở nhiệt độ phòng.
17) Rót bỏ hết dung dịch kháng thể.
18) Rót vào chai lai 20 ml buffer A và cho quay ở nhiệt độ phòng với tốc độ tối đa trong 15 phút.
19) Rót bỏ hết buffer A. Thêm vào chai lai 50 ml dung dịch phát hiện (detection buffer - buffer C), quay ở nhiệt độ phòng 20 phút với tốc độ tối
đa. Lặp lại bước này một lần nữa.
20) Chuyển màng sang một túi chất dẻo (plastic bag, hãng Roche Biochemicals, hãng Kapak...) bằng cách xốc nhẹ chai cho màng lên miệng chai rồi mở nắp rót một nửa buffer C vào túi, đeo găng tay không bụi và dùng hai đầu ngón tay đưa màng sang túi. Lưu ý màng cần sát đáy túi để tiết kiệm dung dịch cơ chất quang hóa (chemiluminescent substrate) vốn đắt tiền.
21) Rót bỏ buffer C khỏi túi lai, đặt túi lên một tấm giấy lọc Whatman 3MM và đặt lên đó một tờ giấy thấm Kimwipe, ép nhẹ (không được nặng tay vì sẽ làm tăng màu nền) cho dịch trong túi thoát ra hết.
22) Mở túi nhẹ nhàng sao cho bề mặt màng không mang DNA vẫn dính sát thành túi. Thêm 1 ml dung dịch CDP-Star (CDP-Star solution) thành dòng dọc theo thành túi (không đưa trực tiếp lên màng). Đặt túi lên một tờ giấy Whatman 3MM sao cho bề chứa DNA ở trên và ép nhẹ thành túi (với giấy Kimwipe) cho dung dịch phân bố đều trên bề mặt của màng một cách chắc chắn. Lưu ý không ép mạnh tránh để lại dấu ép khi hiển thị dò trên film. Bằng một tờ Kimwipe ép nhẹ túi lai cho CDP-Star thoát hết ra ngoài sao cho không còn dịch thừa trên bề mặt màng (trong gốc túi có thể vẫn còn ít dịch). Hàn kín túi bằng một đường hàn nhiệt.
23) Đặt một tấm film X-quang (trong tối) lên túi lai sao cho bề mặt nhũ của film nằm về phía túi (nên để túi sẵn trong một hộp film X-quang), giữ ở nhiệt độ phòng 10 - 15 phút. Thời gian bộc lộ này có thể kéo dài đến 12 giờ. Rửa film X-quang để hiện vị trí dò. Chú ý rằng phát xạ CDP-Star mạnh nhất sau khoảng 20 - 30 phút xử lý và kéo dài đến hơn 24 giờ vì vậy có thể lặp lại việc bộc lộ một số tấm film nếu cần thiết.