III. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA
1.4. Phản ứng dideoxy
Nguyên lý phương pháp như sau. Giả sử ta có đoạn DNA sau vị trí gắn mồi ta có trình tự nucleotide 5'-TCA GAC GTA-3', vậy trình tự bổ sung với nó là 5'-AGT CTG CAT-3'. Nếu ta cho phản ứng tổng hợp DNA trên khuôn DNA này bằng enzyme Klenow hoặc bằng phản ứng luân nhiệt với DNA-polymerase chịu nhiệt như Taq polymerase, rTaq polymerase trong hỗn hợp có mồi nêu trên và bốn loại dNTP trong đó mỗi loại dNTP được thay thế một phần bằng một ddNTP cùng loại. Khi đó, sau phản ứng PCR (xem mục XIV: PCR), từ khuôn DNA một sợi nêu trên, ta có thể có các sản phẩm rất khác nhau do các ddNTP bổ sung ngẫu nhiên tham gia phản ứng và sau đó làm phản ứng dừng lại do không cung cấp đuôi 3'-OH cần thiết cho phản ứng. Như vậy ta sẽ có các sản phẩm sau:
1. ~A*2. ~AG* 2. ~AG* 3. ~AGT* 4. ~AGTC* 5. ~AGTCT* 6. ~AGTCTG* 7. ~AGTCTGC* 8. ~AGTCTGCA* 9. ~AGTCTGCAT*
trong đó ~ là vị trí của mồi (primer), còn A*, T*, G* và C* là các dideoxyribonucleotide tương ứng.
Hình 9: Nguyên lý phản ứng phương pháp dideoxy đọc trình tự nucleotide với bốn ống phản ứng bổ sung bốn ddNTP khác nhau
Nếu với một DNA khuôn duy nhất nếu trên, có bốn ống phản ứng khác nhau mỗi ống có bổ sung chỉ một loại ddNTP và với một mồi trên thì sau khi phản ứng và điện di trên bốn làn gel khác nhau (ddA, ddT, ddG và ddC), ta có thể có các sản phẩm đánh dấu có điểm kết thúc với một nucleotide tương ứng. Nếu điện di trong môi trường có thể phân tách các đoạn này theo độ lớn của khối lượng phân tử (sản phẩm ngắn dịch chuyển nhanh hơn sản phẩm dài) và sau đó xử lý để phát hiện kết quả điện di ta sẽ xác định được trình tự các loại điểm kết thúc theo mức độ tăng dần của đoạn đường dịch chuyển của các băng ở trong gel. Kết quả có thể trình bày như hình dưới đây.
Chiều điện di Trình tự nucleotide sản phẩm phản ứng Kết quả điện di sản phẩm PCR các ống phản ứng với một mồi chung đánh dấu, trên bốn làn kề nhau với
bốn loại ddNTP khác nhau ddA ddT ddG ddC Trình tự sợi khuôn A ▬ T G ▬ C T ▬ A C ▬ G T ▬ A G ▬ C C ▬ G A ▬ T T ▬ A bản gel *Phản ứng dideoxy:
1) Cho vào 4 ống Eppendorf mỗi ống 2 µl một trong các dịch hỗn hợp dNTP/ddNTP các loại G, A, T, C.
2) Cho hỗn hợp gồm 1,0 µl dCTP (16,7 µM), 1,0 µl enzyme Klenow và 1,0 µl [α-32P]dCTP (3.000 Ci/mol) vào dịch DNA khuôn gắn kết với mồi. Trộn đều rồi li tâm nhẹ.
3) Cho hỗn hợp thu được vào các ống A, T, G và C, mỗi ống 2,0 µl. 4) Để 37 ºC cho phản ứng xảy ra.
5) Thêm 2 µl chase solution, để 15 phút ở 37 ºC cho phản ứng xảy ra. 6) Thêm 4 µl dịch màu trộn formamide, trộn đều.
Dịch màu trộn formamide chứa 10 µl formamide, XC 0,05%, BPB 0,05% và EDTA 1mM. Formamide có tác dụng làm ngăn cản sự phục hồi sợi đôi DNA.
7) Biến tính bằng nhiệt ở 90 - 95 ºC trong 3 phút. Tải 2 µl vào mỗi lỗ của gel. Sau khi biến tính bằng nhiệt có thể bảo quản ở −20 ºC.