IV. Phương pháp đánh dấu DNA
3. Đánh dấu đầu mút
3.1. Đánh dấu đầu 5'
3.1.1. Loại bỏ gốc phosphate đầu 5'
1) Hòa tan DNA khuôn (khoảng 5 pmol) vào 45 µl nước, rồi trộn với các hợp chất dưới đây, để cho phản ứng xảy ra trong 1 giờ ở 37 °C: Dung dịch DNA khuôn 45 µl, dung dịch đệm cho dung dịch CIP 10× 5 µl, CIP (phosphatase kiềm ruột bê - calf intestine alkaline phosphatase) hoặc BAP (bacterial alkaline phosphatase) 20 đơn vị.
Dung dịch CIP 10× chứa Tris-HCl (pH 9,0) 0,5M, MgCl2
10mM, ZnCl2 1mM và spermidine 10mM.
2) Chiết xuất bằng phenol-chloroform. Hút lấy phần nước.
3) Cho thêm vào phần nước một lượng NaCl 5M bằng 1/10 so với nước, kết tủa bằng ethanol.
3.1.2. Đánh dấu
Hòa tan DNA đã loại bỏ phosphate đầu 5' rồi thêm vào đó các hóa chất sau: 40 µl dung dịch DNA, 5 µl dung dịch đệm kinase 10×, 5 µl [γ- 32P]ATP (3.000 Ci/mmol) (50 µCi) và 10 đơn vị T4 polynucleotide kinase (Takara, BioRad...).
Cho phản ứng ở 37 °C qua đêm.
Dung dịch đệm kinase 10× chứaTris-HCl (pH 7,5) 0,5M,
MgCl2 0,1M, DTT 50mM, spermidine 1mM và EDTA 1mM.
3.2. Đánh dấu đầu 3'
1) Hòa tan đoạn DNA (~5 pmol) vào 21 µl nước, rồi thêm các hóa chất sau đây: dung dịch DNA 21 µl, dung dịch đệm Klenow 10× 3 µl, [α-32P]CTP 5 µl, các loại dNTP (trừ dCTP, mỗi loại 1 mM) 1 µl, enzyme Klenow 2 đơn vị.
2) Để phản ứng ở 25 °C trong một đêm.
4. Lọc gel
4.1. Sephadex
1) Khuấy 3 g Sephadex G-50 vào 100 ml TNE, hấp cao áp tiệt trùng, bảo quản ở tủ lạnh.
hoặc ống hút Pasteur, nút bông đã loại dầu mỡ và tiệt trùng vào phần thắt của ống. Chú ý không nút quá lỏng hoặc quá chặt tránh chảy gel cũng như tắc dòng chảy.
3) Cho vào đó 1 ml Sephadex G-50, sau đó rót 2 ml TNE để rửa cột.
4) Tải dung dịch DNA (khoảng 25 - 50 µl) lên trong cột, sau đó cho từ từ dung dịch TNE (50 µl) để dung xuất, lấy vào mỗi ống Eppendorf thu mẫu 0,1 ml.
5) Dùng máy đo phóng xạ (scintillation counter) trắc định quang Cerenkov. Đỉnh dung xuất sớm nhất là ở những phân đoạn chứa DNA đã được đánh dấu.
4.2. Phương pháp spin column (cột li tâm) (bằng Bio-Gel P-60)
1) Ngâm 1 g Bio-Gel P-60 (BioRad 100 - 200 mesh) trong 10 ml TE, hấp cao áp tiệt trùng (trong một ống nghiệm 30 hoặc 50 ml). Sau khi hấp cao áp tiệt trùng, lấy ra kiểm tra huyền phù. Bổ sung TE đã tiệt trùng vào ống sao cho cuối cùng lượng Bio-Gel ở lớp dưới bằng lượng TE ở lớp trên, trộn đều trước khi tải cột.
2) Lấy một ống Eppendorf 0,5 ml dùng kim tiêm cỡ 22 chọc một lỗ ở đáy sâu đến nửa phần nghiêng vát của đầu kim. Cho vào ống này 0,3 ml Bio- Gel đã huyền phù hóa trong TE. Lượng gel sẽ là 150 µl. Đặt ống 0,5 ml chứa gel này vào ống Eppendorf 1,5 ml. Đặt ống này vào rotor doãng góc (swing-out rotor), quay li tâm 1.000 v/ph trong 1 phút để loại bỏ TE trong gel, đổ bỏ TE trong ống 1,5 ml. Quay li tâm lần nữa để loại bỏ hết TE. 3) Tải 50 µl dung dịch DNA đã đánh dấu lên trên Bio-Gel, quay li tâm 750 v/ph trong 1 phút. Thu hồi DNA đã đánh dấu vào ống 1,5 ml. Các nucleotide đánh dấu chưa liên kết lưu lại trong gel.
Chú ý: Ngày nay có nhiều kit đánh dấu DNA (RNA) rất hiệu quả và nhanh chóng. Chẳng hạn, kit AlkPhos Direct của hãng Amersham Life Science, có thao tác như sau:
1)Hòa tan 20 µl dung dịch gắn kết (cross-linker solution) với 80 µl nước kèm trong kit để có dung dịch ở nồng độ làm việc.
2) Hòa tan DNA (hoặc RNA) cần đánh dấu đến nồng độ 10 ng/µl với nước kèm trong kit.
3) Cho 10 µl mẫu DNA đã pha loãng trên vào một ống li tâm và biến tính DNA trong 5 phút trong nồi nước đang sôi mạnh.
4) Làm lạnh cấp tốc DNA trên băng. Li tâm nhẹ cho hỗn hợp xuống đáy của ống (không dính thành ống).
5) Thêm 10 µl đệm phản ứng (reaction buffer) vào DNA lạnh. Trộn nhẹ nhàng cho kỹ.
6) Thêm 2 µl chất đánh dấu (labelling reagent), trộn kỹ.
7) Thêm 10 µl dung dịch gắn kết ở nồng độ làm việc (mục 1)). Trộn kỹ, Quay li tâm nhẹ để tập trung hỗn hợp.
8) Ủ phản ứng ở 37 °C trong 30 phút.
9) Mẫu dò có thể sử dụng ngay hoặc giữ trên băng 2 giờ. Nếu bảo quản lâu cần pha vào glycerol 50% và giữ ở −15 ~ −30 °C.