VI. Chế thư viện DNA bổ sung (cDNA library)
6.Sàng lọc thư viện cDNA trong λgt 11 nhờ mẫu dò kháng thể
Đưa cDNA vào vị trí của Eco RI của vector λgt 11 là vị trí kề bên gen lacZ về phía đầu 3' cho nên nếu hướng của khung đọc (reading frame) thích hợp thì sản phẩm protein dung hợp với β-galactosidase sẽ được tổng hợp (xác suất tính toán khoảng 1/6). Protein dung hợp được tổng hợp sẽ tập trung trong tế bào vi khuẩn E. coli chủ, nếu tải vi khuẩn này lên màng (nitrocellulose hoặc nylon) rồi phá vỡ vi khuẩn tạo đốm thẩm (blot) và cho kết hợp với kháng thể đặc hiệu với protein đích sau khi rửa và lại cho tổ hợp này kết hợp với kháng thể đánh dấu (enzyme, phóng xạ (125I)) thì có thể phát hiện được protein đích.
6.1. Cảm nhiễm và cấy trải đĩa
1) Nuôi cấy trước một ngày chủng E. coli (1090 chẳng hạn) bằng môi trường NZYM chứa 0,2% maltose.
2) Thêm 0,2 ml E. coli 1090 đã cấy qua đêm vào 0,1 ml dung dịch SM chứa thư viện trong λgt 11 (chứa khoảng 2 - 10×104 plaque), ủ 15 phút ở 37 ºC.
3) Thêm lượng trên vào khoảng 10 ml NZYM-agarose mềm rồi tráng lên môi trường thạch đường kính 15 cm đã được làm ấm ở 37 ºC. Hong ở 37 ° C (trong buồng vô trùng) cho ráo thạch rồi ủ ở 42 °C trong 3 - 4 giờ (phage λgt 11 tạo plaque rất sớm, sau 3 - 4 giờ). Môi trường mềm agarose được chế bằng cách làm tan 0,7% agarose trong môi trường NZYM, tiệt trùng rồi để nguội ở 50 °C.
6.2. Chuyển thấm protein (protein blotting)
1) Lấy một màng lọc nitrocellulose (hoặc màng nylon) đã hấp cao áp tiệt trùng, làm ướt bằng dung dịch IPTG (isopropyl thiogalactoside, hãng Sigma...) 10mM, hong cho không còn dịch chảy khỏi màng (có thể thấm vào khăn giấy) rồi đánh dấu (bằng bút chì, không được dùng bút bi để tránh nhầm lẫn khi phát màu bằng peroxidase ở các bước sau) tương ứng với số của đĩa môi trường.
2) Đặt màng có số tương ứng lên bề mặt môi trường đĩa đã hình thành plaque, ủ ở 37 °C trong 3,5 giờ. Dùng kim tiêm chọc thủng màng lẫn thạch môi trường để đánh dấu vị trí. Khi cần chuyển thấm lên hai màng thì lấy màng thứ nhất ra rồi đặt lên môi trường màng thứ hai, đâm kim đánh dấu, rồi ủ với thời gian và nhiệt độ tương tự.
3) Lấy màng khỏi môi trường, tráng nhẹ trong dung dịch TBST khoảng 1 phút.
Dung dịch TBST chứa Tris-HCl (pH 7,9) 50mM, NaCl
150mM và Tween-20 0,05%.
4) Ủ màng trong TBST chứa 20% huyết thanh bê 30 phút ở 37 ºC. Cũng có thể thay huyết thanh bê (FCS) bằng albumin huyết thanh bê (BSA), huyết thanh ngựa, gelatin hoặc sữa đã loại bơ (skim milk).
6.3. Ủ với mẫu dò kháng thể
Sử dụng phương pháp này để sàng lọc thì kết quả phụ thuộc nhiều vào chất lượng kháng thể. Có thể dùng kháng huyết thanh nhưng dùng kháng thể đơn dòng cũng tốt. Kháng thể phải có hiệu giá cao. Thêm vào đó, trong nhiều trường hợp nếu không được tinh chế qua cột sắc ký hấp phụ thì các kháng thể đặc hiệu E. coli (chủ) tạo nền dương tính giả. Do đó trước khi sàng lọc cần sắc ký loại bỏ các kháng thể không mong muốn này khỏi kháng huyết thanh cần sử dụng.
1) Chọn độ pha loãng thích hợp: chuyển thấm khoảng 1 ng kháng nguyên lên màng lọc (nitrocellulose hay nylon) cho tiếp xúc (nhỏ lên màng) huyết thanh có độ pha loãng dần từ 200 - 1.000 lần trong TBS pha 20% huyết thanh bê. Sử dụng nồng độ pha có tỷ số signal/background cao nhất.
2) Loại bỏ kháng thể đặc hiệu E. coli: Tập trung tế bào vi khuẩn E. coli
chủng Y-1090 từ 500 ml lứa cấy qua đêm, trộn đều vào 20 ml nước cất, xử lý trong 5 - 10 phút ở 100 ºC, quay li tâm 10.000 v/ph thu lấy nước mặt. Trộn 1 ml dịch mặt này với 100 ml kháng thể, để 2 giờ ở 4 ºC, quay li tâm 10.000 v/ph trong 15 phút, thu nước mặt để thực hiện sàng lọc. Cũng có
thể lấy dịch dung giải E. coli pha thêm cho được NaHCO3 (pH 9,0) 0,1M và NaCl 0,5M rồi cố định vào cột Sepharose 4 B (hãng Pharmacia) đã hoạt hóa bằng CNBr rồi dùng để xử lý (lọc) kháng thể.
3) Ủ màng (có đốm thẩm) 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong dung dịch TBST- FCS 20%. Nếu ủ 10 tấm màng thì cần khoảng 50 ml (FCS: fetal calf serum - huyết thanh bê). Có thể ủ trong đĩa Petri, khi ủ cần trộn đảo nhẹ.
4) Rửa 3 lần bằng khoảng 100 ml TBST mỗi lần 3 phút để loại bỏ những kháng thể và protein không kết hợp đặc hiệu.
5) Ủ với kháng thể đánh dấu (kháng thể thứ hai, hay conjugate đặc hiệu với γ-globulin loài động vật đã cho kháng huyết thanh - tức cho kháng thể thứ nhất) (có thể mua từ nhiều hãng như Miles, BioRad...). Trước tiên pha loãng conjugate theo nồng độ chỉ định của nhà sản xuất (pha loãng 1.000 lần), cần pha khoảng 50 ml. Cũng có thể sử dụng conjugate đánh dấu phóng xạ bằng 132I (trong thành phần protein A liên kết với kháng thể). 6) Rửa bằng khoảng 100 ml TBS 3 lần mỗi lần 3 phút, lại rửa bằng 100 ml TBST 10 phút và sau đó bằng TBS cũng 10 phút. Nếu dùng conjugate phóng xạ thì thực hiện tự ký phóng xạ (autoradiography).
7) Ngâm màng lọc vào dung dịch cơ chất của enzyme tương ứng đã gắn trên conjugate (ví dụ, TMB hoặc 5-aminosalicylic acid với HRPO hay horse radish peroxidase). Nếu 10 màng cần 50 ml. Thời gian ngâm khoảng 20 - 40 phút, để lâu hơn có thể làm đậm màu nền.
8) Rửa màng bằng nước cất rồi sấy khô.
9) Nếu có clone dương tính thì thực hiện sàng lọc lại (secondary screening), bắt đầu từ việc tìm vị trí plaque dương tính, cạo agarose kề bên hòa vào môi trường thích hợp... tương tự như đã trình bày ở mục trước.