III. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA
1.2.Điều chế dung dịch nucleotide cho phản ứng dideoxy
Để điều chế dung dịch nucleotide phải sử dụng nước cất hoặc nước lọc siêu sạch đã hấp cao áp tiệt trùng còn bảo quản thì phải ở −20 ºC. 1) Điều chế dung dịch 10 mM mỗi loại nucleotide dNTP trong nước cũng như dung dịch ddNTP làm dung dịch tồn trữ, bảo quản ở −20 ºC.
2) Pha dịch hỗn hợp dNTP (các dịch nucleotide có giảm lượng từng loại): pha loãng 20 lần dịch tồn trữ đậm đặc các loại (thành dung dịch 0,5mM các loại), sau đó pha bốn hỗn hợp trong bốn ống (G0, A0, T0 và C0) với lượng các loại theo bảng sau.
Nếu sử dụng [α-32P]dCTP hoặc [α-35S]dCTPαS thì Dung dịch G0 A0 T0 C0 dGTP 0,5mM 1 µl 20 µl 20 µl 20 µl dATP 0,5mM 20 µl 1µl 20 µl 20 µl dTTP 0,5mM 20 µl 20 µl 1 µl 20 µl TE 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl
Nếu sử dụng [α-32P]dATP hoặc [α-35S]dATPαS thì Dung dịch G0 A0 T0 C0 dGTP 0,5mM 1 µl 20 µl 20 µl 20 µl dATP 0,5mM 20 µl 20 µl 1 µl 20 µl dTTP 0,5mM 20 µl 20 µl 20 µl 1 µl TE 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl
3) Các dịch phản ứng ddNTP được điều chế từ dung dịch tồn trữ (ở mục 1.) nêu ở trên):
- 0,15mM ddGTP: 3,0 µl ddGTP tồn trữ + 197 µl nước; - 0,3mM ddATP: 6,0 µl ddATP tồn trữ + 194 µl nước; - 0,4mM ddTTP: 8,0 µl ddTTP tồn trữ + 192 µl nước; - 0,1mM ddCTP: 2,0 µl ddCTP tồn trữ + 198 µl nước. 4) Dịch hỗn hợp dNTP/ddNTP: -G/G0: 17 µl G0 + 10 µl dịch phản ứng ddGTP; -A/A0: 13 µl A0 + 10 µl dịch phản ứng ddATP; -T/T0: 19,1 µl T0 + 10 µl dịch phản ứng ddTTP; -C/C0: 36 µl C0 + 10 µl dịch phản ứng ddTTP.
Chú ý: Dịch hỗn hợp dNTP/ddNTP là dịch được đưa vào bốn ống phản ứng khác nhau. Trong mỗi ống nếu nồng độ ddNTP quá cao thì phản ứng sẽ nhanh chóng dừng lại và ta không thể xác định được trình tự khá dài, khi đó cần phải chỉnh giảm lượng ddNTP để có phản ứng tối ưu.
5) Dịch bổ khuyết (chase solution): pha 5 µl mỗi loại dNTP tồn trữ với 80 µl nước cất (mỗi loại trong một ống).
6) Với [α-32P]dCTP, thường cần pha thêm dCTP không đánh dấu. Nếu hoạt tính phóng xạ tương đối của [α-32P]dCTP cao (3.000 Ci/mmol) thì có thể tăng tỷ lệ dCTP không đánh dấu pha thêm. Còn nếu hoạt tính phóng xạ tương đối của [α-32P]dCTP thấp (khoảng 400 Ci/mmol) thì không cần phải làm giảm hoạt tính phóng xạ bằng dCTP phi phóng xạ.