Việc điều chế RNA từ tổ chức hoặc từ lứa cấy tế bào động vật là những thao tác không thể thiếu đối với Northern blot hybridization và chế tác thư viện DNA bổ sung (cDNA liabrary). Tuy nhiên, do RNA rất dễ bị RNase phân giải nên cần có những chú ý hơn so với điều chế DNA. Các chất ức chế RNase thai người cũng như các loại chất ức chế như tổ hợp vanadyl (vanadyl complex) không hoàn toàn ức chế được tác dụng của RNase. Do đó, điểm cần chú ý khi điều chế RNA là sau khi trích xuất tổ chức cần phải cho thêm guanidine thiocyanate và phenol vào ngay để làm biến tính RNase không để cho RNase có thời gian kịp tác dụng. Trong trường hợp mẫu được bảo quản đông lạnh cũng cần cắt tổ chức thành các mảnh khoảng 1 g và cho vào nitơ lỏng để đông kết rồi bảo quản ở −80 ºC. Để tránh RNase gây nhiễm vào tay và dụng cụ phải chú ý đeo găng tay (loại dùng một lần, nếu nghi nhiễm cần thay ngay), dụng cụ thủy tinh cần nung ở 200 °C trong 4 giờ, những dụng cụ khác không thể xử lý nhiệt được thì ngâm vào dung dịch nước ôxy già (H2O2) 5% rồi rửa sạch bằng nước cất hoặc là ngâm một đêm trong dung dịch diethyl pyrocarbonate (ethoxyformic anhydride) 0,1% qua đêm rồi hấp cao áp tiệt trùng. Các dịch không thể hấp cao áp thì lọc qua lọc 0,22 hoặc 0,45 μm. Trong ngày làm việc điều chế RNA cần chú ý không làm những thí nghiệm khác để tránh ô nhiễm RNase.
1. Phương pháp guanidine thiocyanate
1) Nghiền lứa khoảng 1 - 3 g tổ chức hoặc 2 - 4×108 tế bào lứa cấy trong dung dịch guanidine thiocyanate 5,5M (GTC 5,5M). Nếu là lứa cấy tế bào đơn lớp thì rửa bằng dung dịch PBS(-) một số lần rồi cho GTC 5,5M trực tiếp vào đĩa Petri có lứa cấy. Chỉ cần trộn kỹ là có thể làm vỡ tế bào. Nếu tổ chức là gan chỉ cần dùng nghiền cối thủy tinh (Teflon glass) cũng có thể nghiền nát dễ dàng, nhưng tổ chức là cơ thì nếu không sử dụng máy nghiền Polytron thì khó nghiền nát. Dù trường hợp nào đi nữa thì cũng cần làm nhanh.
Dung dịch guanidine thiocyanate 5,5M (GTC 5,5M) chứa
GTC 5,5M, sodium citrate 15mM và sarkosyl 0,5%, điều chỉnh pH bằng NaOH đến 7,0 rồi lọc qua lọc, trước khi dùng cho thêm 2- mercaptoethanol cho đạt đến 0,2 M. (Chú ý nếu lượng GTC 5,5M ít hơn tổ chức thì có thể tỷ lệ thu hồi RNA giảm).
chế bằng cách hòa tan 8,0 g (0,137 M) NaCl, 0,2 g (2,68 mM) KCl, 0,2 g (1,47 mM) KH2PO4 và 0,2 g (8,06 mM) Na2HPO4.7H2O vào 1 lít nước cất, hấp cao áp tiệt trùng.
2) Cho dịch nghiền vào syringe 50 ml có gắn kim tiêm cỡ 18, bơm cho dịch nghiền đi qua làm cắt đứt DNA một cách cơ giới, làm giảm độ nhớt của dịch. (Có thể dùng hai bơm tiêm đấu nối qua một kim hai gốc để bơm từ bơm tiêm này sang bơm tiêm khác và ngược lại nhiều lần).
3) Cho dung dịch CsTFA-EDTA 0,1M (tỷ trọng 1,51) vào ống li tâm siêu tốc (RPS-25 hoặc RPS-27 của Hitachi, chẳng hạn) đã tiệt trùng bằng hấp cao áp cho đến nửa ống, tải mẫu nguyên liệu lên rồi quay li tâm 23.000 v/ph ở 15 °C trong 24 giờ, RNA sẽ đọng ở đáy ống còn DNA và protein còn lại trong dung dịch.
Dung dịch CsTFA-EDTA 0,1M gồm CsTFA (cesium
triflouracetate) và dung dịch EDTA (pH 8,0) 0,25M, thêm nước cho đến tỷ trọng 1,51.
4) Dùng pipet đầu dài hút bỏ hết lớp dịch chứa DNA, protein... ở trên. Nếu ở dưới còn sót lớp CsTFA thì lộn ngược để bỏ hết phần dịch. Đặt ngược ống lên giấy thấm hay khăn giấy 5 phút cho chảy hết dịch. Lấy giấy thấm (Kimwipe) lau nhẹ phần trong lòng ống cho hoàn toàn hết dịch sót trong thành ống. Lật ống lại khi không còn thấy dòng dịch chảy ngược về đáy ống.
5) Hòa tan cặn (RNA) trong 4 ml GTC 4M (GTC 5,5M pha với nước cất cho được GTC 4M). Nên cho GTC từ từ, mỗi lần 1 ml, rồi chuyển qua ống mới (Falcon 2059 chẳng hạn, cho tiện li tâm). RNA trở nên ngưng tụ và khó hòa tan nhưng sau khi hút chuyển nếu trộn xoáy mạnh sẽ tan. Quay li tâm 10.000 v/ph trong 10 phút để loại bỏ tạp chất, hút lấy dịch mặt cho sang ống mới. Cho vào dịch này 100 µl citric acid 1M (đã qua lọc) rồi thêm 3 ml ethanol, để ở −20 °C trong 3 giờ.
6) Quay li tâm 10.000 v/ph trong 20 phút, đổ bỏ nước mặt. Hòa tan cặn trong 3 ml TE, lại quay li tâm 10.000 v/ph trong 10 phút hút lấy nước mặt chuyển sang ống khác (loại bỏ tạp chất). Thêm vào nước mặt 0,3 ml NaCl 2M và 6 ml ethanol, rồi để kết tủa ở −20 ºC.
2. Phương pháp phenol nóng
Để thực hiện lai Northern và tạo thư viện cDNA... phương pháp guanidine thiocyanate nêu trên giúp điều chế được lượng lớn RNA thuần khiết cao (ít tạp chất) là rất cần thiết, nhưng trong trường hợp có một lượng nhỏ tế bào và phải điều chế đồng thời nhiều loại RNA thì phương
pháp phenol nóng (hot phenol method) là rất tiện lợi.
1) Cạo lứa cấy tế bào từ 2 - 3 đĩa Petri nuôi cấy, cho vào ống rồi rửa bằng dung dịch TNE, sau đó huyền phù hóa trong TNE.
2) Thêm vào 0,5 ml SDS 10%, cho phenol đã làm nóng đến 65 °C rồi để ở 65 °C trong 15 phút thỉnh thoảng khuấy mạnh, sau đó đảo trộn ở nhiệt độ phòng thêm 10 phút.
3) Quay li tâm 3.000 v/ph trong 10 phút, lấy phần nước.
4) Chiết xuất bằng phenol 2 lần, bằng chloroform 1 lần, kết tủa bằng ethanol.
5) Hòa tan tủa trong 300 µl dung dịch chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM và MgCl2 10mM.
6) Thêm vào 140 đơn vị DNase (RNase-free, hãng Takara, BioRad...), để phản ứng ở 4 °C trong 3 giờ.
7) Chiết xuất bằng phenol-chloroform (1:1), kết tủa bằng ethanol, tráng bằng ethanol 70% rồi pha TE để có nồng độ thích hợp.