(dot blot hybridization)
Đối với việc phân tích RNA đặc hiệu thể hiện trong tế bào hay tổ chức, sau khi điện di có thể sử dụng các phương pháp Northern blot để xác định độ lớn và lượng của chúng, và với mẫu RNA pha loãng dần có thể bán định lượng bằng phương pháp phân tích dot blot (thẩm đốm). Trong cả hai trường hợp đều cần phải làm biến tính RNA rồi cố định lên màng (nitrocellulose, nylon) rồi kiểm xuất RNA bằng mẫu dò đặc hiệu. Phương pháp biến tính RNA có thể là phương pháp formaldehyde, glyoxal, hydroxymethyl thủy ngân. Dưới đây mô tả phương pháp Northern blot dùng formaldehyde và phương pháp dot blot dùng hydroxymethyl thủy ngân (CH3HgOH). Mặc dù mô tả ở đây nhưng tác giả khuyến cáo không nên dùng hydroxymethyl thủy ngân vì rất độc cũng như nếu sử dụng thời gian kéo dài sẽ có tác động môi trường trầm trọng nếu không có quy chế quản lý sớm.
Phương pháp dot blot đơn giản, hữu hiệu khi muốn đồng định số lượng lớn mẫu RNA lượng lớn nhưng nhiều khi (do nhiễm nhiều protein...) nền thường đậm và có khả năng cho kết quả dương tính với RNA khác loại nhưng có sự tương đồng (trình tự nucleotide). Trong phương pháp phân tích Northern blot, do kiểm xuất được RNA dưới dạng một băng đặc hiệu nên không gặp trở ngại trên. Cho nên thông thường cần thực hiện phân tích dot blot chọn ra các mẫu dương tính để phân tích Northern blot với mẫu dò đặc hiệu.
1. Northern hybridization (biến tính RNA bằng formaldehyde)
1) Ngâm bản gel, lược, chậu điện di trong xà phòng rồi rửa kỹ, sau đó ngâm chúng vào nước ôxy già (H2O2) 5% khoảng 1 giờ, lại rửa nước. Ngâm rửa kỹ như vậy để tránh tác động của RNase vốn rất sẵn do vi khuẩn, nấm... sản sinh và rất bền trong tự nhiên.
2) Cho nước đã tiệt trùng vào agarose, làm tan chảy sau đó thêm 1/5 lượng cần thiết dung dịch đệm điện di 5×, cho formaldehyde cho đạt 2,2 M. Nếu
cần chế 40 ml gel agarose 1% thì cân 0,4 g agarose, thêm 24,8 ml nước tiệt trùng, gia nhiệt làm dung giải, sau đó cho 8,0 g dung dịch đệm điện digel 5× và 7,2 ml formaldehyde, trộn đều, rồi chế bản gel.
Dung dịch đệm gel điện di 5× chứa MOPS (3-
(morpholino)propane sulfonic acid) (pH 7,0) 0,2M, sodium acetate 50mM và EDTA 5mM, hấp cao áp tiệt trùng.
3) Điều chế mẫu: cho vào trong một ống Eppendorf 4,5 µl (gần 20 µg) RNA, 2,0 µl dung dịch đệm gel điện di 5×, 3,5 ml formaldehyde, 10,0 µl formamide, trộn đều, để 15 phút ở 55 ºC.
4) Thêm 2 µl dung dịch màu tải mẫu 10×, điện di ở 100 V, size marker cũng xử lý tương tự và cùng điện di cho đến khi BPB tiến gần đến mép cuối của gel là được.
Dung dịch màu tải mẫu 10× chứa glycerol ở nồng độ
50%, EDTA 1mM, BPB 0,4%, XC 0,4%, hấp cao áp tiệt trùng. 5) Ngâm gel trong nước 5 phút, khi đó thay nước một số lần.
6) Ngâm gel trong dịch chứa NaOH 50mM và NaCl 10mM trong 10 phút. 7) Ngâm gel 10 phút trong Tris-HCl 0,1M pH 7,5.
8) Ngâm gel 20 phút trong SSC 10×.
9) Chuyển rồi lai như đối với Southern hybridization, nhưng sau khi chuyển không rửa bằng dịch có nồng độ muối thấp trước khi làm khô.
Chú ý: Size marker có thể là DNA đánh dấu phóng xạ nhưng marker không đánh dấu cũng tốt, xử lý biến tính tương tự với mẫu RNA. Cũng có thể sử dụng RNA marker (28S, 18S rRNA...), điện di đồng thời với RNA mẫu, có thể quan sát dưới UV sau khi nhuộm gel bằng ethidium bromide. Khi đó, ngâm gel 30 phút, thay nước một số lần, ngâm vào ammonium acetate 0,1M 30 phút, ngâm vào dung dịch chứa ethidium bromide 0,5 µg/ml, ammonium acetate 0,1M và 2-mercaptoethanol 0,1M. Sau đó ngâm 30 phút trong dịch chứa ammonium acetate 0,1M và 2- mercaptoethanol 0,01M.
2. Dot blot hybridization (sử dụng hydroxymethyl thủy ngân)
1) Ngâm thiết bị thẩm đốm (blotting apparatus) 1 giờ trong hydroxymethyl thủy ngân 10%, rửa nước.
Thiết bị thẩm đốm cấu tạo từ một khay mẫu là một tấm
phẳng có khoan sẵn hàng loạt lỗ để nếu lót ở phía dưới một tấm màng cho sát khay mẫu và nhỏ dung dịch mẫu lên trên thì dung dịch mẫu thoát qua màng và các nucleic acid sẽ được giữ lại trong màng, một hoặc hai tấm đệm cho khay mẫu và một khoang chân không (khay) ở phía dưới nối với một máy hút chân không hoặc vòi hút.
2) Ngâm một màng lọc 12 cm × 8 cm trong nước, sau khi ngấm hoàn toàn thì ngâm trong SSC 20× trong 1 giờ.
3) Thiết định màng vào thiết bị blotting (trên tấm gôm kẹp giữa khoang chân không và khay mẫu), đồng thời để tránh hydroxymethyl thủy ngân thoát ra cần phải thiết lập chai bẫy nước (water trap) cho máy hút (aspirator) hoặc bơm chân không.
4) Hòa tan RNA (đến 20 µg) trong SSC 3×, CH3HgOH 10mM, chế dãy pha loãng trong dung dịch này. Cho máy hút chạy nhẹ tạo áp suất âm vừa phải, nhỏ khoảng 30 µl mẫu lên mỗi lỗ khay mẫu, mẫu sẽ được hút vào màng. Hút khoảng 20 - 30 phút.
5) Xử lý nhiệt cho khô màng rồi thực hiện tương tự đối với Southern hybridization. Để giảm phát màu nền cần lai tiền khởi, tức thực hiện việc che phủ, hay phong bế, các phần chưa kết hợp của màng. Với mục đích đó có thể dùng sữa loại bơ (skim milk) hoặc nhũ thanh (iris cream liquor).