III. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA
1.1. Điều chế DNA khuôn
1.1.1. Phage hệ M 13mp
*Tái tạo dòng trong phage hệ M 13mp:
1) Bằng T4 DNA ligase ta kết nối (ligate) đoạn DNA cần xác định trình tự nucleotide với vài chục nanogram DNA vector được điều chế nhờ phân cắt DNA dạng tái tạo (RF - replicative form) của phage hệ M 13mp bằng enzyme hạn chế thích hợp.
2) Trộn dịch kết nối với 100 - 200 µl E. coli chịu di nạp JM 105, để trên nước đá 40 phút.
3) Xử lý nhiệt 2 phút ở 42 ºC hoặc ở 50 ºC trong 50 giây (gây sốc nhiệt). 4) Để lại trong nước đá (khoảng 5 phút).
5) Rót agarose (0,6 - 0,7%) trong TY 2× vào ống có nắp đã tiệt trùng rồi bảo ôn ở 42 ºC. Trộn vào 3,0 ml agarose (0,6 - 0,7% trong TY 2×) lần lượt các thành phần gồm 25 µl IPTG (100 mM), 100 µl dịch vi khuẩn JM 105 đã bồi dưỡng 1 đêm, 100 - 200 µl vi khuẩn đã di nạp (phage) và 50 µl dung dịch X-Gal (2%) trong dimethyl formamide rồi trải trên môi trường đĩa LB. Hong ráo mặt thạch.
Môi trường TY 2× chứa 16 g tryptone, 10 g cao nấm men,
5 g NaCl và nước cất q.s. 1.000 ml.
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoline-β-galactoside) được pha 2% trong dimethyl formamide trước khi dùng, nhưng cũng có thể pha rồi cất ở −20 ºC trong ống với lượng nhỏ đủ dùng hết một lần.
6) Để cho mặt thạch rắn, ủ ở nhiệt độ phòng trên mặt phẳng. 7) Lật đĩa, ủ ở 37 ºC trong 1 đêm.
Những thể đã tổ hợp hình thành những plaque đục (turbid plaque), các thể không tổ hợp hình thành những plaque màu lục (blue plaque), các
thể khuyết tổn cũng hình thành plaque đục nhưng rất hiếm. *Điều chế DNA một sợi:
1) Cho 2 ml môi trường TY 2× vào ống nghiệm có nắp đã tiệt trùng.
Môi trường TY 2× 16 g chứa tryptone, 10 g cao nấm men
(yeast extract), 5 g NaCl, hòa trong 1 lít nước cất, hấp cao áp tiệt trùng.
2) Cấy 20 µl lứa cấy JM 105 đã qua đêm vào mỗi ống TY 2×.
3) Dùng que tăm đã tiệt trùng cấy plaque đục vào các ống. Cần chú ý để cấy các plaque độc lập.
4) Ủ 5 - 6 giờ ở 37 ºC trên máy lắc, cần lắc mạnh, nếu lắc không đủ sẽ phát triển kém, lượng thu được của phage sẽ ít. Quay li tâm ống nghiệm nuôi cấy 3.000 v/ph trong 2 phút.
5) Thu nước mặt chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml. Quay li tâm 12.000 v/ph trong 5 phút.
6) Chuyển 1,3 ml dịch mặt sang ống Eppendorf mới, chú ý để dịch không lẫn tế bào vi khuẩn.
7) Thêm 20 µl dung dịch PEG 6000 20% - NaCl 2,5M, trộn đều, để 15 phút.
8) Quay li tâm 12.000 v/ph trong 5 phút, loại bỏ nước mặt. Khi này có thể nhìn thấy tủa phage, đặc biệt nếu dùng rotor cố định góc (angle rotor) thì dễ nhận thấy tủa phage hơn.
9) Quay li tâm thêm 2 - 3 phút ở 12.000 v/ph, loại bỏ nước mặt, có thể hút bằng pipet hoặc dốc ống đổ đi.
10) Hòa tủa phage trong 100 µl TE 10mM. Thêm 50 µl phenol hoặc 100 µl phenol-chloroform (1:1), trộn đều, để nhiệt độ phòng 15 phút.
11) Trộn lần nữa rồi quay li tâm ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, dùng rotor doãng góc (swing-out rotor) thì tốt hơn.
12) Hút nước mặt sang ống Eppendorf mới, thêm 10 µl sodium citrate 3M (pH 6,0), 250 µl ethanol, trộn đều.
13) Để kết tủa ở −20 ºC trong 1 đêm.
14) Quay li tâm 10 phút ở 12.000 - 16.000 v/ph ở 4 ºC trong 10 phút. 15) Loại bỏ nước mặt, tráng bằng ethanol 70%.
16) Lại li tâm, loại bỏ hết nước mặt.
17) Làm khô tủa DNA bằng máy làm khô bằng chân không, hoặc để khô tự nhiên.
18) Hòa tan DNA vào TE, tùy lượng DNA nhiều hay ít mà thêm lượng TE thích hợp. Bảo quản ở −20 °C.
1.1.2. Plasmid hệ pUC
1) Clone hóa đoạn DNA cần xác định trình tự nucleotide vào plasmid hệ pUC, điều chế DNA plasmid bằng phương pháp kiềm (phương pháp Birnboim).
2) Thêm 2 µl NaOH 2N vào 18 µl dung dịch DNA (trên 0,5 pmol), để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
3) Thêm 8 µl ammonium citrate 5M, sau đó 100 µl ethanol để kết tủa. 4) Để trên đá khô (dry ice) 5 phút hoặc ở −20 ºC 30 phút cho tạo kết tủa. 5) Quay li tâm 12.000 - 16.000 v/ph trong 5 phút ở 4 ºC, loại bỏ nước mặt. 6) Tráng bằng ethanol 70%.
7) Quay li tâm lần nữa, loại bỏ nước mặt.
8) Để khô hay hút khô bằng máy làm khô bằng chân không (buồng chân không), bảo quản ở −20 ºC.