nhuộm Gram:
1. Các đặc điểm của tiêu bản cố định:
Quan sát tiêu bản cố định là là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật vì nó có những ưu điểm sau:
- Thao tác tuy phức tạp nhưng tiêu bản có màu sắc đẹp, giữ được lâu. - Không sợ lây nhiễm khi làm việc với vi sinh vật gây bệnh.
- Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng, cấu tạo của tế bào cũng như dễ dàng đếm số lượng tế bào.
2. Cách làm tiêu bản:
a. Làm vết bôi:
Đặt một giọt nước sạch vào giữa phiến kính, sau đó dùng que cấy đã khử trùng lấy một vòng que cấy vi sinh vật cho vào giọt nước và dàn đều ra. Trường hợp nuôi cấy trên môi trường lỏng thì dùng pipet để lấy dung dịch nghiên cứu. Hơ khô phiến kính đã có vi sinh vật trên ngọn lửa đền cồn hoặc để khô tự nhiên ta được một vết mờ trên phiến kính gọi là vết bôi.
Chú ý:
- Lượng vi sinh vật lấy vừa phải. - Vết bôi tròn, gọn, thật mỏng.
- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều, dễ quan sát.
b. Cố định vết bôi:
- Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:
+ Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là vi sinh vật gây bệnh).
+ Gắn chặt vi sinh vào phiến kính để lúc nhuộm không bị rửa trôi. - Các cách cố định:
+ Cố định bằng nhiệt: dùng kẹp gỗ để kẹp phiến kính, hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần (chừng vài ba giây), tránh không để tiêu bản quá nóng.
+ Cố định bằng hoá chất:
* Nhúng vết bôi vào cồn 95o khoảng 10 – 15 phút rồi sấy khô. * Ngâm trong axeton 5 phút.
* Sấy bằng hơi formol 10 – 15 giây.
3. Phương pháp nhuộm đơn:
Nhuộm đơn là dùng 1 loại thuốc nhuộm để nhuộm. Các loại thuốc nhuộm thường dùng để nhuộm đơn là:
- Fuchsin kiềm.
- Xanh metylen.
- Tím gentian.
Phương pháp nhuộm: đặt tiêu bản đã cố định lên giá rồi nhỏ vài giọt thuốc nhuộm phủ kín vết bôi. Sau 1 – 2 phút, đổ thuốc nhuộm đi và rửa nhẹ bằng nước sạch tới khi nào thấy nước rửa chảy qua vết bôi không còn màu nữa là được. Để tiêu bản khô dần hoặc thấm khô bằng giấy thấm. Khi tiêu bản khô hẳn đem quan sát dưới kính hiển vi.
4. Phương pháp nhuộm Gram:
Đây là phương pháp thường được dùng trong thực nghiệm vi sinh vật học. Phương pháp nhuộm kép do nhà bác học người Đan mạch là Christian Gram và những người cộng tác đưa ra năm 1884. Với phương pháp nhuộm này người ta có thể phân biệt vi sinh vật thành 2 nhóm: Gram dương (G+) và Gram âm (G-).
Vi sinh vật bắt màu tím sau khi nhuộm gọi là vi sinh vật Gram dương (bao gồm hầu hết xạ khuẩn, trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí, nấm mốc, nấm men, cầu khuẩn). Còn những vi sinh vật bắt màu hồng gọi là Gram âm như trực khuẩn sinh bào tử kỵ khí, một số cầu khuẩn như lậu cầu khuẩn, não mô cầu khuẩn...
a. Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau:
- Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương.
- Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi bị xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm.
b. Cách tiến hành:
- Làm vết bôi từ ống giống đã nuôi cấy 24 giờ. Để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
- Đặt giấy lọc lên trên vết bôi.
- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút.
- Nhỏ dung dịch lugol lên trên vết bôi, giữ 1 phút rồi đổ đi.
- Rửa tiêu bản bằng nước rồi tẩy bằng cồn 950 trong 0,5 phút, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu.
- Rửa tiêu bản bằng nước.
- Nhuộm bổ sung Fuchsin lên vết bôi 10 – 30 giây.
- Rửa bằng nước, để khô tự nhiên hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn và đem quan sát dưới kính hiển vi.
1. Thuốc nhuộm F uchsin kiềm:
(1) Cồn 96o 10 ml Fuchsin kiềm
0,3 gam
(2) Phênol (axit phênic) 5 gam Nước cất
95 ml
Trộn dung dịch (1) với (2) và pha loãng 5 lần.
Xanh mêtylen 0,1 gam
Nước cất 1000ml
3. Thuốc nhuộm tím gentian (tím kết tinh):
(1) Gentian violet 1 gam Cồn 96o
10 ml
(2) Phenol 5 gam Nước cất
100 ml
Trộn (1) với (2) và lọc trong. Để dịch lọc trong lọ màu.
4. Lugol:
KI 2 gam
I2 tinh thể 1 gam
Nước cất 300 ml
Hoà 2 gam KI vào 5 ml nước cất, sau đó thêm 1 gam I2 vào chờ cho I2 tan hết mới thêm nước cất đủ 300 ml.
Bài 2. PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG
(4 tiết)I. Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm: I. Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm:
Trong công tác nghiên cứu vi sinh vật, chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm là khâu rất quan trọng và có tính chất quyết định đến kết quả nghiên cứu sau này.
Các dụng cụ nghiên cứu vi sinh vật thông thường gồm: hộp petri, pipet, các ống nghiệm, bình tam giác, bình cầu, que gạt thuỷ tinh...
Trước hết phải rửa thật sạch các dụng cụ thí nghiệm bằng xà phòng từ 1 – 2 lần, rồi tráng lại bằng nước cất. Để khô tự nhiên hoặc sấy khô.
Sau đó tiến hành làm nút bông đối với các dụng cụ có nắp (bình tam giác, ống nghiệm, bình cầu), khi làm nút bông cần chú ý: không làm lỏng quá hay chặt quá, đầu nút bông phải tròn, gọn, không méo mó hoặc xổ bông ra.
Tiếp theo dùng giấy báo gói các dụng cụ thí nghiệm lại và đưa vào tủ sấy để khử trùng. Thường sấy ở nhiệt độ 160OC – 170OC trong 1,5 đến 2 giờ. Không nên để nhiệt độ vượt quá 180OC bởi vì nhiệt độ quá cao có thể làm nút bông và giấy báo cháy xém. Khi đạt nhiệt độ và thời gian quy định thì ngắt điện, để nhiệt độ của tủ sấy hạ dần xuống 60OC mới được mở tủ để lấy dụng cụ. Nếu mở tủ khi nhiệt độ chưa hạ xuống thấp dễ gây sự nứt vỡ các dụng cụ thí nghiệm.
Các dụng cụ đã khử trùng xong đem cất vào nơi khô ráo sạch sẽ, khi nào cần sử dụng mới bóc bỏ giấy bao gói.