IV. Phần thực hành:
Bài 4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG ĐẤT (
tiết)
Khu hệ vi sinh vật đất có mối quan hệ mật thiết với cây trồng, vì thế việc xác định vi sinh vật trong đất có vai trò rất quan trọng, giúp ta biết được số lượng cũng như thành phần vi sinh vật trong đất. Ttrên cơ sở đó mà có những biện pháp tích cực tạo điều kiện cho những vi sinh vật có ích phát triển và hạn chế sự có mặt của những vi sinh vật có hại. Để xác định vi sinh vật trong đất người ta có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó có 2 phương pháp dưới đây được dùng nhiều hơn cả:
- Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng cách đém dưới kính hiển vi nhờ phòng đếm hồng cầu.
- Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc tạo thành khi nuôi cấy trên môi trường đặc.
Để xác định số lượng vi sinh vật trong đất phải tiến hành qua các bước sau:
I. Lấy mẫu đất:
Việc lấy mẫu đất phải đảm bảo các yêu cầu sau: - Lấy mẫu có tính chất dại diện.
- Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đ ặc tínhlý, hoá, sinh học của đất.
- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng.
- Lấy mẫu xong phải phân tích ngay không được để quá 24 giờ.
- Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu mẫu, thời gian lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, đặc điểm của vùng lấy mẫu (đất đai, cây trồng, thời tiết khí hậu, địa hình...).
Mẫu đất lấy về cần phân tích ngay, nếu để qus 24 giờ một số vi khuẩn sẽ chết, hoặc một số bào tử nấm và vi khuẩn có thể nảy nở thêm hoặc vi sinh vật ở không khí xâm nhập vào làm cho thành phần và số lượng vi sinh vật trong đất thay đổi đi. Nếu trường hợp chưa phân tích được ngay thì phải bảo quản trong tủ lạnh có nhiệt độ khoảng 4 – 5oC.
II. Pha loãng mẫu:
- Chuẩn bị 2 bình tam giác dung tích 250 ml, bình thứ nhất chứa 99 ml nước cất vô trùng, bình thứ hai để không và một số ống nghiệm có chứa 9 ml nước cất vô trùng.
- Khử trùng cối, chày sứ bằng cách cho vào một ít cồn và đốt lên, sau đó để nguội.
- Cân 1 gam đất cho vào cối sứ đã vô trùng.
- Lấy 0,5 – 1 ml nước cát vô trùng ở bình tam giác thứ nhất cho vào cối sứ có đất để làm nhão đất. Dùng chày sứ đã vô trùng nghiền nát trong vòng 5 phút.
- Dùng toàn bộ nước ở bình thứ nhất để chuyển hỗn hợp đất đã nghiền nát vào bình tam giác không.
- Lắc bình có chứa dung dịch đất trong 5 phút, để yên 30 phút để làm lắng các hạt lớn. Dung dịch đất trong bình tam giác này có độ pha loãng 100 lần (10-2).
- Lấy 1 ml dung dịch đất có độ pha loãng 100 lần cho vào ống nghiệm thứ nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng, trộn đều dung dịch bằng cách hút lên rồi thổi xuống 3 – 5 lần ta được độ pha loãng 10-3.
- Tiếp tục hút 1 ml ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml nước cất vô trùng thứ hai, trộn đều dung dịch như trên ta có độ pha loãng 10-4.
- Cứ tiếp tục hút như vậy từ ống nghiệm thứ hai sang ống nghiệm thứ 3, từ ống 3 sang ống 4... ta sẽ có các độ pha loãng 10-5, 10-6...
III. Xác định trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng phòng đếm hồng cầu:
Phương pháp này thường dùng để đếm số lượng vi sinh vật có kích thước tương đối lớn như nấm men, bào tử nấm mốc, các loại tảo. Người ta thường dùng hai loại phòng đếm hống càu là Thomas và Goriaep.
Nguyên tắc cấu tạo của phòng đếm: đó là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng, khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông . Mỗi ô vuông lại được chia ra thành 16 ô vuông nhỏ , mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều dày là 1/10 mm, như vậy thể tích 1 ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3 hay 1/4000.000 ml. Phòng đếm có 1 lá kính dày để đậy.
Cách đếm:
- Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu.
- Nhỏ 1 giọt dung dịch mẫu vào giữa phòng đếm và đậy lại bằng phiến kính, chú ý không để tạo bọt khí.
- Di chuyển nhẹ nhàng phòng đếm để dung dịch mẫu tràn đầy các khoang.
- Đặt phòng đếm lên bàn kính hiển vi, để yên 3 – 5 phút, sau đó tiến hành đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau (chọn 4 ô ở 4 góc và một ô ở chính giữa).
Cách đếm số tế bào trong mỗi ô lớn như sau: mỗi ô nhỏ có 4 cạnh giới hạn, đếm số lượng tế bào nằm trọn trong ô và những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều, ví dụ: đếm cạnh bên dưới và cạnh bên phải. Đếm các ô từ trái sang phải, từ hàng trên xuống hàng dưới rồi đổi chiều. Cứ đếm như vậy cho đến ô cuối cùng của 16 ô con.
- Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu được tính bằng công thức:
4000.103
N = a . . 10n
b
Trong đó:
N là số tế bào trong 1 gam mẫu.
a là số lượng tế bào trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ). b là số ô nhỏ trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ).
103 là số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1 ml) 10n là độ pha loãng của mẫu.
Chú ý: + Sau khi sử dụng xong phòng đếm phải rửa sạch ngay và lau
khô để bảo quản.
+ Trị số trung bình của số tế bào đếm được trong 1 ô nhỏ phải đảm bảo không lớn hơn 10 tế bào và không nhỏ hơn 2,5 tế bào mới đảm bảo độ chính
xác của phương pháp.
IV. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc
tạo thành khi nuôi cấy trên môi trường đặc:
1. Nguyên tắc của phương pháp: cấy một thể tích dung dịch mẫu nhất định lên môi trường đặc trưng trong hộp petri, sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên sau một lên môi trường đặc trưng trong hộp petri, sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên sau một thời gian nuôi cấy nhất định. Khi đó ta coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ 1 tế bào hay bào tử.
2. Phương pháp cấy mẫu:
- Dùng pipet vô trùng lấy 0, 1 ml (tương đương 2 giọt) dung dịch mẫu cho vào mỗi hộp petri.
- Dùng que gạt dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào. Chú ý: ghi vào nắp hộp petri nồng độ pha loãng của dịch cấy và ngày cấy. - Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ cấy ít nhất 3 hộp petri, sau đó lấy kết quả trung bình.
- Đặt các hộp petri đã cáy vào tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật.
- Sau đó lấy ra và đếm số khuẩn lạc trong từng hộp petri.
3. Cách đếm:
- Lấy bút chì kẻ 2 hoặc đường chéo ở đáy hộp petri (tuỳ theo số khuẩn lạc mọc ít hay nhiều) chia hộp thành 4 hoặc 8 phần, đánh dấu thứ tự từng phần từ 1 – 4 hoặc từ 1 – 8.
- Đếm số khuẩn lạc từng phần, nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm để tránh trùng lặp.
- Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1 gam đất được tính theo công thức sau:
1
N = X . . M . K
V
Trong đó: N là số tế bào vi sinh vật hay số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong 1 gam đất
X là số khuẩn trung bình trong mỗi hộp petri ở cùng độ pha loãng. V là thể tích dung dịch mẫu cấy vào mỗi hộp petri.
M là độ pha loãng dùng để cấy.
K là hệ số khô kiệt của đất (K = 100/(100 – x), x là độ ẩm của đất) Chú ý: độ pha loãng thích hợp nhất là độ pha loãng mà số khuẩn lạc đếm được trong mỗi hộp petri sau khi nuôi cấy là 50 – 150 khuẩn lạc (đối với vi khuẩn, xạ khuẩn) và 30 – 50 khuẩn lạc đối với nấm.