- Đối với môi trường đặc:
+ Cân agar rồi ngâm vào nước, đung cho tan agar.
+ Cân hoá chất rồi hoà tan trong nước.
+ Trộn dung dịnh hóa chất vào agar đã tan thêm nước vào cho đủ, khuấy và đun cho tan đều.
b. Làm trong môi trường:
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật cần phải trong, có như thế mới quan sát vi
sinh vật được một cách dễ dàng. Có thể làm trong môi trường bằng những cách sau:
Lọc qua bông, vải thưa nhiều lớp hay giấy lọc.
Dùng lòng trắng trứng gà: cứ một lít môi trường dùng một lòng trắng trứng. Lấy riêng lòng trắng, cho thêm một lượng nước bằng nó rồi đánh tan cho đến khi sủi bọt thì đổ vào môi trường và trộn đều, đun sôi 10 – 15 phút, để lắng rồi lọc.
c. Điều chỉnh pH môi trường.
Mỗi loài vi sinh vật chỉ phát triển trong một khoảng pH nhất định. Do đó, khi làm môi trường cần điều chỉnh pH cho thích hợp. Người ta thường dùng các dung dịch sau để điều chỉnh pH môi trường: HCl, H2SO4, NaOH, NaHCO3... có nồng độ
0,1N hoặc 10%.
d. P hân phối môi trường.
Sau khi điều chỉnh pH thì phân phối môi trường vào các bình cầu, ống nghiệm đã chuẩn bị từ trước. Riêng đối với hộp petri nếu không có dụng cụ để giữ khi khử trùng thì khử trùng môi trường xong mới phân phối vào các hộp petri.
- Đối với ống nghiệm: nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì môi trường cần được phân phối chiếm ¼ thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ ½ - 1/3 thể tích ống nghiệm.
- Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm ½ - 1/3 thể tích của bình.
- Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc.
e. Khử trùng môi trường.
Sau khi pha chế xong thì phải khử trùng môi trường. Có thể khử trùng bằng một trong 3 phương pháp sau:
* Hấp bằng hơi nước sôi ở áp suất thường.
Đối với các môi trường lỏng không chịu được nhiệt độ cao thì có thể khử trùngở nhiệt độ thấp theo kiểu P axtơ hay kiểu Tyndan.
- Kiểu Paxtơ: dựa trên cơ sở phần lớn vi sinh vật không bào tử chết ở 60 – 70OC trong khoảng 15 – 30 phút, hoặc 70 – 80OC trong khoảng 5 – 10 phút. Như vậy, theo kiểu này là người ta hấp ở nhiệt độ hơi nước sôi khoảng 30 – 40 phút. Khử trùng bằng phương pháp này chỉ có các tế bào sinh dưỡng bị tiêu diệt, các bào
tử vẫn có khả năng sống sót cho nên phương pháp này chỉ dùng để khử trùng sữa,
bia và một số thực phẩm khác.
- Kiểu Tyndan: Đây là phương pháp khử trùng triệt để ở nhiệt độ thấp bằng cách hấp gián đoạn. Theo phương pháp này người ta hấp 3 -4 lần ở nhiệt độ hơi nước sôi (1000C) mỗi lần 30 – 40 phút. Lần nọ cách lần kia 24 giờ, giữa hai lần hấp lấy môi trường ra đểvào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp với nhiệt độ nảy mầm của bào tử vi sinh vật (thường là 28 – 300C). Sở dĩ làm như vậy vì những bào tử còn sống sót trong lần hấp trước, khi gặp nhiệt độ thích hợp sẽ nảy mầm và chúng sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp sau đó.
* Hấp bằng hơi nước sôi ở áp suất cao (dùng nồi áp suất – autoclave).
Để khử trùng các loại môi trường (không chứa các loại đường dễ bị phá huỷ) thông thường người ta sử dụng nồi hấp (autoclave) khử trùng ở 1 atm trong thời gian 20 phút. Nếu môi trường đựng trong các bình lớn từ 1 lit trở lên thì khử trùng trong 30 phút. Đối với những môi trường chứa đường dễ bị biến chất ở nhiệt độ cao thì có thể khử trùng ở 0,5 – 0,6atm trong 15 phút.
Khi khử trùng bằng nồi áp suất cần lưu ý những điểm sau:
- Các dụng cụ (bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm...) cần có nút bông chặt vừa phải, bên ngoài có bọc bao làm bằng giấy dầu hay giấy báo để tránh hơi nước làm ướt nút bông.
- Phải kiểm tra mức nước trong nồi áp suất đã đủ chưa (xem ở vạch ngang ghi trên ống thuỷ tinh lắp bên ngoài nồi hấp).
- Khi đóng các khoá nồi hấp cần vặn từng đôi một đối xứng nhau để nắp
không bị vênh, không bị hở. Khi mở cũng phải mở từng đôi đối xứng nhau.
- Phải loại hết không khí trong nồi ra mới khoá van thoát hơi nước nước để áp suất trong nồi tăng lên. Có thể loại bỏ hết không khí trong nồi bằng một trong các cách sau:
+ Đóng khoá thoát hơi nước để tăng áp suất trong nồi lên khoảng 0,5atm rồi mở van thoát hơi để áp suất hơi nước đó tống tất cả không khí lạnh ra khỏi nồi, cho đến khi áp suất trở về không thì đóng van lại và tiếp tục cho tăng áp suất đến mức cần thiết.
+ Mở van thoát hơi nước ngay từ đầu khi hơi nước bắt đầu thoát ra thành một luồng hơi trắng khá mạnh, đều thì đóng khoá lại và cho tăng áp suất đến mức cần thiết.
- Khi khử trùng xong, ngắt điện cho áp suất hạ xuống 0, để nhiệt độ trong nồi giảm hẳn mới được mở nắp lấy môi trường ra.
* Lọc qua màng lọc vi khuẩn.
Phương pháp này thường dùng đối với một số môi trường không thích hợp với biện pháp khử trùng bằng nhiệt độ cao (môi trường huyết thanh, dung dịch albumin...).
f. Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri:
- Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc:
+ Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng nhưng không được để môi trường chạm vào nút bông.
+ Để yên cho đến khi mặt thạch đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải phẳng, nhẵn, liên tục.
- Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc.
- Đổ thạch vào đĩa petri: toàn bộ quá trình này phải thực hiện trong tủ cấy vô trùng và gồm các thao tác sau:
+ Mở bao giấy gói các hộp petri.
+ Tay phải cầm dụng cụ (bình tam giác) chứa môi trường.
+ Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn.
+ nghiêng bình và rót nhẹ một chút môi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắp trên của hộp.
+ Đậy nắp trên lại, xoay tròn hộp petri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa.
+ Để yên cho môi trường nguội và đông đặc.
+ Lật ngược hộp petri để hơi nước bốc ra và khô dần đi.
Chú ý: thao tác đổ thạch phải nhanh và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2 mm. Thông thường cứ 1 lít môi trường đổ được 22 – 25 hộp. Sau khi đổ môi trường vào hộp, để 1 – 2 ngày để xem môi trường có bị nhiễm hay không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập.
g. Bảo quản và kiểm tra môi trường:
- Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ bảo quản từ 0 – 5oC và không để môi trường bị khô.
- Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 37oC, trong 48 – 72 giờ. Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống, các hộp có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống, hộp có môi trường đạt yêu cầu.