IV. Phần thực hành:
Bài 2 PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG
(4 tiết)I. Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm: I. Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm:
Trong công tác nghiên cứu vi sinh vật, chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm là khâu rất quan trọng và có tính chất quyết định đến kết quả nghiên cứu sau này.
Các dụng cụ nghiên cứu vi sinh vật thông thường gồm: hộp petri, pipet, các ống nghiệm, bình tam giác, bình cầu, que gạt thuỷ tinh...
Trước hết phải rửa thật sạch các dụng cụ thí nghiệm bằng xà phòng từ 1 – 2 lần, rồi tráng lại bằng nước cất. Để khô tự nhiên hoặc sấy khô.
Sau đó tiến hành làm nút bông đối với các dụng cụ có nắp (bình tam giác, ống nghiệm, bình cầu), khi làm nút bông cần chú ý: không làm lỏng quá hay chặt quá, đầu nút bông phải tròn, gọn, không méo mó hoặc xổ bông ra.
Tiếp theo dùng giấy báo gói các dụng cụ thí nghiệm lại và đưa vào tủ sấy để khử trùng. Thường sấy ở nhiệt độ 160OC – 170OC trong 1,5 đến 2 giờ. Không nên để nhiệt độ vượt quá 180OC bởi vì nhiệt độ quá cao có thể làm nút bông và giấy báo cháy xém. Khi đạt nhiệt độ và thời gian quy định thì ngắt điện, để nhiệt độ của tủ sấy hạ dần xuống 60OC mới được mở tủ để lấy dụng cụ. Nếu mở tủ khi nhiệt độ chưa hạ xuống thấp dễ gây sự nứt vỡ các dụng cụ thí nghiệm.
Các dụng cụ đã khử trùng xong đém cất vào nơi khô ráo sạch sẽ, khi nào cần sử dụng mới bóc bỏ giấy bao gói.
II. Phương pháp pha chế môi trường dinh dưỡng:
1. Môi trường dinh dưỡng:
Môi trường dinh dưỡng là môi trường có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết đối với sự phát triển của vi sinh vật, cũng như các yếu tố vật lí và hoá học phù hợp với các hoạt động sống của chúng.
Người ta dùng môi trường để phân lập, nhân giống, giữ giống các loại vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh lí, sinh hoá của chúng.
Bất kỳ một môi trường dinh dưỡng nào cũng phải có các yếu tố sau đây: - Có đầy đủ chất dinh dưỡng ần thiết.
- Có pH thích hợp
- Hoàn toàn vô trùng.
Tuỳ theo thành phần và nguồn gốc người ta chia môi trường dinh dưỡng làm 3 loại:
Thành phần hoá học của môi trường này không được xác định chính xác do tính chất không ổn định của sản phẩm tự nhiên.
- Môi trường tổng hợp là môi trường được pha chế bằng các hoá chất,
nên thành phần hoá học của môi trường này được biết một cách cụ thể.
- Môi trường bán tổng hợp tức là sử dụng cả hoá chất lẫn chất hữu cơ tự nhiên.
Căn cứ vào tính chất lý học, có thể chia môi trường nuôi cấy vi sinh vật thành 3 loại:
- Môi trường lỏng (dịch thể): thành phần môi trường này không chứa thạch (agar) và thường được dùng để nghiên cứu các dặc điểm sinh lý, sinh hoá, sinh khối, các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật.
- Môi trường đặc: trong thành phần môi trường này có chứa 1,5 – 2,0% agar hoặc 10 – 20% gelatin và thường dùng để nghiên cứu các đặc diểm hình thái, sinh lý của vi sinh vật, đánh giá các giống thuần khiết, giữ giống, đếm số lượng vi sinh vật.
- Môi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,35 – 0,7%.
- Môi trường xốp: như môi trường kê nấu nhừ, cám, cát thạch anh có thấm dung dịch dinh dưỡng, và thường được ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp
Khi chế tạo môi trường đặc người ta thường dùng agar, đây là một loại
polyssaccharit phức tạp thu nhận được từ một số loại tảo biển . Trong nước, agar
tạo thành dạng gen và chảy ra ở nhiệt độ 100OC. Còn gelatin là loại protein nhận được khi ninh xương và sụn động vật. Gel tạo thành bởi gelatin bị chảy lỏng ra ở nhiệt độ 23 – 36OC, tức là thấp hơn so với nhiệt độ nuôi cấy bình thường của nhiều vi sinh vật (30 – 37OC), ngoài ra nó còn bị dịch hoá bởi proteaza do một số vi sinh vật tiết vào môi trường.
2. Phương pháp làm môi trường:
Việc pha chế môi trường đòi hỏi phải chính xác và cẩn thận. Đây là một trong những khâu quan trọng bậc nhất trong công tác nghiên cứ vi sinh vật. Nếu môi trường không đảm bảo yêu cầu và kém phẩm chất thì sẽ ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu.
Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng:
b. Pha chế: cân đong thật chính xác từng thành phần môi trường theo đúng trình tự hướng dẫn trong tài liệu. trình tự hướng dẫn trong tài liệu.
- Đối với môi trường lỏng: cân, đong các chất rồi hoà tan trong nước.- Đối với môi trường đặc: - Đối với môi trường đặc:
+ Cân agar rồi ngâm vào nước, đung cho tan agar.
+ Cân hoá chất rồi hoà tan trong nước.
+ Trộn dung dịnh háo chất vào agar đã tan thêm nước vào cho đủ, khuấy và dun cho tan đều.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật cần phải trong, có như thế mới quan sát vi
sinh vật được một cách dễ dàng. Có thể làm trong môi trường bằng những cách sau:
Lọc qua bông, vải thưa nhiều lớp hay giấy lọc.
Dùng lòng trắng trứng gà: cứ một lít môi trường dùng một lòng trắng trứng. Lấy riêng lòng trắng, cho thêm một lượng nước bằng nó rồi đánh tan cho đến khi sủi bọt thì đổ vào môi trường và trộn đều, đun sôi 10 – 15 phút, để lắng rồi lọc.
c. Điều chỉnh pH môi trường.
Mỗi loài vi sinh vật chỉ phát triển trong một khoảng pH nhất định. Do đó, khi làm môi trường cần điều chỉnh pH cho thích hợp. Người ta thường dùng các dung dịch sau để điều chỉnh pH môi trường: HCl, H2SO4, NaOH, NaHCO3... có nồng độ
0,1N hoặc 10%.
d. P hân phối môi trường.
Sau khi điều chỉnh pH thì phân phối môi trường vào các bình cầu, ống nghiệm đã chuẩn bị từ trước. Riêng đối với hộp petri nếu không có dụng cụ để giữ khi khử trùng thì khử trùng môi trường xong mới phân phối vào các hộp petri.
- Đối với ống nghiệm: nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì môi trường cần được phân phối chiếm ¼ thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ ½ - 1/3 thể tích ống nghiệm.
- Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm ½ - 1/3 thể tích của bình.
- Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc.
e. Khử trùng môi trường.
Sau khi pha chế xong thì phải khử trùng môi trường. Có thể kử trùng bằng một trong 3 phương pháp sau:
* Hấp bằng hơi nước sôi ở áp suất thường.
Đối với các môi trường lỏng không chịu được nhiệt độ cao thì có thể khử trùngở nhiệt độ thấp theo kiểu paxtơ hay kiểu tyndan.
- Kiểu Paxtơ: dựa trên cơ sở phần lớn vi sinh vật không bào tử chết ở 60 – 70OC trong khoảng 15 – 30 phút, hoặc 70 – 80OC trong khoảng 5 – 10 phút. Như vậy, theo kiểu này là người ta hấp ở nhiệt độ hơi nước sôi khoảng 30 – 40 phút. Khử trùng bằng phương pháp này chỉ có các tế bào sinh dưỡng bị tiêu diệt, các bào tử vẫn có khả năng sống sót cho nên phương pháp này chỉ dùng để khử trùng sữa,
bia và một số thực phẩm khác.
- Kiểu Tyndan: Đây là phương pháp khử trùng triệt để ở nhiệt độ thấp bằng cách hấp giai đoạn. Theo phương pháp này người ta hấp 3 -4 lần ở nhiệt độ hơi nước sôi (100OC) mỗi lần 30 – 40 phút. Lần nọ cách lần kia 24 giờ, giữa hai lần hấp lấy môi trường ra đểvào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp với nhiệt độ nảy mầm của bào tử vi sinh vật (thường la 28 – 30OC). Sở dĩ làm như vậy vì những bào tử còn sống sót trong lần hấp trước, khi gặp nhiệt độ thích hợp sẽ nảy mầm và chúng sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp sau đó.
* Hấp bằng hơi nước sôi ở áp suất cao (dùng nồi áp suất – autoclave).
Để khử trùng các loại môi trường (không chứa các loại đường dễ bị phá huỷ) thông htường người ta sử dụng nồi hấp (autoclave) khử trùng ở 1 atm trong thời gian 20 phút. Nếu môi trường đựng trong các bình lớn từ 1 lit trở lên thì khử trùng trong 30 phút. Đối với những môi trường chứa đường dễ bị biến chất ở nhiệt độcao thì có thể khử trùng ở 0,5 – 0,6atm trong 15 phút.
Khi khử trùng bằng nồi áp suất cần lưu ý những điểm sau:
- Các dụng cụ (bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm...) cần có nút bông chặt vừa phải, bên ngoài có bọc bao làm bằng giấy dầu hay giấy báo để tránh hơi nước làm ướt nút bông.
- Phải kiểm tra mức nước trong nồi sáp suất đã đủ chưa (xem ở vạch ngang ghi trên ống thuỷ tinh lắp bên ngoài nồi hấp).
- Khi đóng các khoá nồi hấp cần vặn từng đôi một đối xứng nhau để nắp
không bị vênh, không bị hở. Khi mở cũng phải mở từng đôi đối xứng nhau.
- Phải loại hết không khí trong nồi ra mới khoá van thoát hơi nước nước để áp suất trong nồi tăng lên. Có thể loại bỏ hết không khí trong nồi bằng một trong các cách sau:
+ Đóng khoá thoát hơi nước để tăng áp suất trong nồi lên khoảng 0,5atm rồi mở van thoát hơi để áp suất hơi nước đó tống tất cả không khí lạnh ra khỏi nồi, cho đến khi áp suất trở về không thì đóng van lại và tiếp tục cho tăng áp suất đến mức cần thiết.
+ Mở van thoát hơi nước ngay từ đầu khi hơi nước bắt đầu thoát ra thành một luồng hơi trắng khá mạnh, đều thì đóng khoá lại và cho tăng áp suất đến mức cần thiết.
- Khi khử trùng xong, ngắt điện cho áp suất hạ xuống 0, để nhiệt độ trong nồi giảm hẳn mới được mở nắp lấy môi trường ra.
* Lọc qua màng lọc vi khuẩn.
Phương pháp này thường dùng đối với một số môi trường không thích hợp với biện pháp khử trùng bằng nhiệt độ cao (môi trường huyết thanh, dung dịch albumin...).
h. Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri:
- Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc:
+ Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng nhưng không được để môi trường chạm vào nút bông.
+ Để yên cho đến khi mặt thạch đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải phẳng, nhẵn, liên tục.
- Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc.
- Đổ thạch vào đĩa petri: toàn bộ quá trình này phải thực hiện trong tủ cấy vô trùng và gồm các thao tác sau:
+ Tay phải cầm dụng cụ (bình tam giác) chứa môi trường. + Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn.
+ nghiêng bình và rót nhẹ một chút môi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắp trên của hộp.
+ Đậy nắp trên lại, xoay tròn hộp petri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa.
+ Để yên cho môi trường nguội và đông đặc.
+ Lật ngược hộp petri để hơi nước bốc ra và khô dần đi.
Chú ý: thao tác đổ thạch phải nhanh và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2 mm. thong thường cứ 1 lít môi trường đổ được 22 – 25 hộp. Sau khi đổ môi trường vào hộp, để 1 – 2 ngày để xem môi trường có bị nhiễm hay không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập.
i. Bảo quản và kiểm tra môi trường:
- Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ bảo quản từ 0 – 5oC và không để môi trường bị khô.
- Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 37oC, trong 48 – 72 giờ. Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống, các hộp có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống, hộp có môi trường đạt yêu cầu.
III. Công thức một số môi trường dinh dưỡng thông dụng:
5. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
b. Môi trường nước thịt – pepton:
Nước chiết thịt 1000 ml
Peptôn 10 gam
NaCl 5 gam
Cách chế nước chiết thịt:
- Thịt bò tươi lọc sạch gân, mỡ, bạc nhạc, đem xay hoặc thái nhỏ. Cứ 500
gam thịt thêm 1000 ml nước.
- Đun nóng từ từ, giữ ở 50oC trong 1 giờ. Sau đó đun sôi 30 phút. - Để nguọi và lắng trong dung dịch vừa đun.
- Lọc bằng vải hay giấy lọc.
- Phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng. b. Môi trường nước mắm – peptôn:
Nước mắm 35o đạm 30 ml.
Peptôn 10 gam
Nước cất bổ sung đến 1000 ml pH = 7, khử trùng 1 atm/30 phút.
c. Môi trường thạch – nước thịt – peptôn:
Nước thịt 1000 ml
Peptôn 10 gam
Thạch 20 gam
6. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn:
c. Môi trường Gauze 1:
Tinh bột tan 20 gam
K2HPO4 0,5 gam
MgSO4. 7 H2O 0,5 gam
KNO3 1,0 gam
NaCl 0,5 gam
FeSO4 0,1 gam
Nước cất 1000 ml
pH = 7,2 – 7,4.
d. Môi trường tinh bột – đạm sunphát:
(NH4)2SO4 1,0 gam
K2HPO4 1,0 gam
NaCl 1,0 gam
MgSO4.7H2O 1,0 gam
Tinh bột tan 10 gam
Nước máy 1000 ml
pH = 7,0.
7. Môi trường nuôi cấy nấm men:
d. Môi trường giá đậu – đường: cân 100 gam giá dậu. Thêm 1000 ml nước. Đun sôi 30 phút. Lọc lấy dịch trong. Bổ sung nước cho đủ 1000 ml và thêm 50 gam đường. Nếu làm môi trường đặc thì bổ sung 20 gam thạch. e. Môi trường Sabouraud:
Peptôn 10 gam
Mantoza/ glucoza 40 gam
Nước 1000 ml
pH = 5,5 – 6,0. f. Môi trường Hansen:
Glucoza/Mantoza hoặc đường kính 50 gam Peptôn 10 gam K2HPO4 3,0 gam MgSO4. 7H2O 2,0 gam Nước 1000 ml.
8. Môi trường nuôi cấy nấm mốc:
c. Môi trường Czapec:
Saccaroza 30 gam K2HPO4 1,0 gam NaNO3 30 gam MgSO4. 7 H2O 0,5 gam FeSO4 0,01 gam Nước cất 1000 ml
pH = 6. Khử trùng 1 atm/30 phút d. Môi trường Martin:
Glucoza 10 gam Peptôn 5,0 gam K2HPO4 1,0 gam MgSO4. 7H2O 0,5 gam Rosebengan (1/3000) 100 ml Nước cất 900 ml Streptomixin (1%) 3 ml
Bài 3. SỰ CHUYỂN HOÁ CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CHỨA N VÀ KHÔNG CHỨA N (4 tiết)
I. Sự chuyển hoá các hợp chất hữu cơ chứa N:
1. Quá trình amôn hoá: a. Amôn hoá protein: a. Amôn hoá protein:
* Các bước tiến hành thí nghiệm:
- Tiến hành pha môi trường: 30 gam pepton, 1000ml nước cất.
- Đưa môi trường vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 5 – 7 ml moi trường.
- Khử trùng môi trường ở 1 atm trong 15 phút.
- Đặt vào thành ống nghiệm và nút bông 1 mảnh giấy quỳ đỏ có thấm nước vô trùng.
- Cho vào ống nghiệm một ít dung dịch đất.
- Để vào tủ ấm 28 – 30oC trong thời gian 1 tuần.
* Phân tích kết quả:
- Xác định sự có mặt của NH3: nếu tạo thành NH3 thì giấy quỳ đỏ chuyển thành xanh.
- Làm tiêu bản nhuộm đơn, quan sát các vi sinh vật amon hoá: chủ yếu là Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, đây là những trực khuẩn Gram dương, ngoài ra
còn có mọt số vi khuẩn Gram âm khác.
b. Amôn hoá urê:
* Các bước tiến hành thí nghiệm:
- Pha môi trường: urê 5 gam, K2HPO4 0,5 gam, nước cất 100 ml.
- Cho vào bình tam giác 100 ml, mỗi bình 30 ml môi trường.
- Khử trùng 1 atm trong 15 phút. - Cho vào bình tam giác một ít đất.
- Để 1 mảnh giấy quỳ đỏ treo ở nút bông của bình tam giác.