3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.3.2. Tinh sạch POS qua cột sắc ký
Để đánh giá hoạt tính sinh học và các đặc tính khác của POS cũng nhƣ nhằm ứng dụng POS trong y dƣợc, cần phải tinh sạch POS nghĩa là loại bỏ các sản phẩm phụ (monogalacturonic acid, pectin khối lƣợng phân tử thấp...) ra khỏi hỗn hợp oligosaccharide. Nhƣ trên đã trình bày, pectin khối lƣợng phân tử thấp đƣợc loại khỏi dung dịch nhờ phƣơng pháp lọc 2 bƣớc lần lƣợt qua màng 10 kDa và 1 kDa, với monogalacturonic acid một số tác giả báo cáo có thể sử dụng phƣơng pháp sắc ký lọc gel và lọc nano để tách riêng monogalacturonic acid ra khỏi hỗn hợp oligosaccharide, do đó trong phần này sử dụng phƣơng pháp sắc ký lọc gel với gel Toyopearl GigaCap Q-650M để đánh giá hiệu quả quá trình lọc.
Dịch POS sau khi lọc qua màng 1 kDa đƣợc tinh sạch tiếp bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel. Gel Toyopearl GigaCap Q-650M đƣợc nhồi vào cột và chạy 1 ml dung dịch POS lên cột, rửa chiết và thu các phân đoạn 1,5 ml vào từng ống riêng. Xác định hàm lƣợng từng thành phần, hiệu suất thu hồi và biểu diễn kết quả trên bảng 3.20 và hình 3.29.
Hình 3.29 Các ph n đoạn POS khi lọc gel (A) và TLC sản phẩm khi tinh sạch (B)
1: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; 2: dịch POS sau khi lọc qua màng 10 kDa ; 3: dịch POS sau khi lọc qua màng 1 kDa; 4: dịch chiết ở phân đoạn 15, 5:
dịch chiết ở phân đoạn 40
Kết quả hình 3.29A cho thấy dịch POS sau khi lọc thu đƣợc 2 đỉnh tƣơng ứng với phân đoạn 13 – 24 và phân đoạn 34 – 41. Phân tích thành phần của 2 đỉnh này trên bản sắc ký hình 3.29B cho thấy ở phân đoạn 15 (đỉnh 1) chỉ chứa digalacturonic acid và trigalacturonic acid (giếng 4), còn ở phân đoạn 40 (đỉnh 2) chỉ chứa monogalacturonic acid (giếng 5). Với phân đoạn POS từ 13 – 24, tổng hàm lƣợng POS thu đƣợc là 379,7 mg nhƣ vậy hiệu suất thu hồi POS sau khi lọc gel là 78,6% (bảng 3.21).
Bảng 3.21 Hiệu suất thu hồi POS sau khi lọc gel
Tổng lƣợng POS (mg)
Tổng lƣợng mono galacturonic acid (mg)
Hiệu suất thu hồi (%)
Dịch qua màng 1 kDa 398,4 ± 1,7 30,2 ± 0,5 82,5 ± 1,75
Dịch sau lọc gel 379,7 ± 1,5 0 78,6 ± 1,78
Mặc dù sử dụng gel Toyopearl GigaCap Q-650M đã tách đƣợc monogalacturonic acid ra khỏi hỗn hợp digalacturonic acid và trigalacturonic acid nhƣng với phƣơng pháp này vẫn chƣa tách riêng rẽ đƣợc digalacturonic acid và trigalacturonic acid ra khỏi nhau, có thể do cột chƣa đủ dài để tách hoặc điều kiện, đệm chạy chƣa tối ƣu. Để định lƣợng đƣợc từng thành phần oligosaccharide có trong hỗn hợp POS cần phải có các nghiên cứu thêm về loại gel, loại cột hay chế độ lọc,...
A B G2 G1 G3 G1 G2 + G3
Nhƣ vậy, dịch POS sau khi lọc gel không chứa monogalacturonic acid và chỉ bao gồm digalacturonic acid và trigalacturonic acid.