3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng A niger sinh tổng hợp EPG cao
Việc tìm kiếm chủng A. niger có khả năng tổng hợp EPG cao để chủ động tạo ra nguồn enzyme ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và đặc biệt ứng dụng trong sản xuất POS đang đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Để chọn lọc đƣợc chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao, trong phần này, các thí nghiệm đƣợc tiến hành qua ba bƣớc. Bƣớc đầu, các chủng đƣợc phân lập dựa trên đƣờng kính khuẩn lạc trên môi trƣờng chứa cơ chất pectin, bƣớc tiếp theo các chủng đƣợc sàng lọc qua đƣờng kính vòng thủy phân và hoạt độ polygalacturonase của sinh khối. Bƣớc cuối cùng, các chủng đƣợc lựa chọn theo hoạt độ endopolygalacturonase cao.
Từ một số nguồn vỏ quả cam, táo, bƣởi, cà phê, cà rốt giàu pectin mua tại một số chợ trên địa bàn Hà Nội (tháng 1/2013) đã phân lập đƣợc 40 chủng nấm sợi trên môi trƣờng Czapeck. Các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc Czapeck- pectin ở 30oC. Sau 3 ngày nuôi quan sát và xác định đƣờng kính khuẩn lạc. Trong số 40 chủng nấm mốc phân lập chỉ có 16 chủng có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa pectin và trong đó có 7 chủng có đƣờng kính khuẩn lạc >3 cm (bảng 3.1).
Bảng 3.1Nguồn gốc và đặc điểm của các chủng nấm mốc phân l p từ nguồn vỏ quả
STT Ký hiệu
Nguồn gốc Đặc điểm của chủng
Thời gian xuất hiện bào tử (ngày)
Màu của khuẩn lạc
Đƣờng kính khuẩn lạc (cm)
1 T1 Vỏ táo 3 Đen 3,2
2 B3 Vỏ bƣởi Diễn 2 Đen 3,5
3 C5 Vỏ cam sành 2 Đen 3,6
4 CF1 Vỏ quả cà phê 3 Nâu đen 3,3
5 CR1 Vỏ cà rốt 3 Đen 3,2
6 C2 Vỏ cam Hà Giang 2 Đen 4,0
7 B2 Vỏ bƣởi Năm Roi 2 Đen 3,8
Các chủng phân lập đƣợc này đều mang những đặc điểm hình thái tƣơng tự nhƣ của
trắng, mặt trái khuẩn lạc không màu; cuống bào tử nhẵn, vách dày, không màu; phần cuối cuống bào tử mở rộng tạo thành bọng hình cầu, thể bình 2 tầng, bào tử hình cầu, ráp, xẻ rãnh [32] (hình 3.1).
Hình 3.1 Khuẩn lạc, hệ sợi và bào tử chủng CF1 trên m i trư ng Czapeck (sau 3 ngày nuôi, 30oC)
Bảng 3.2 Giá trị bán kính vòng thủy phân của các chủng nấm mốc thử nghiệm
TT Kí hiệu chủng D - d (mm) TT Chủng D - d (mm) 1 CNTP5011 3,5 20 CNTP5014 3,5 2 CNTP5032 3,5 21 CNTP5013 6,0 3 CNTP5003 4,5 22 CNTP5008 3,5 4 CNTP5004 5,0 23 CNTP5055 4,0 5 CNTP5009 3,5 24 CNTP5023 3,5 6 CNTP5021 3,5 25 CNTP5034 3,5 7 CNTP5015 3,0 26 CNTP5016 4,0 8 CNTP5006 3,5 27 BK01 4,0 9 CNTP5017 6,5 28 CĐN4 4,0 10 CNTP5033 3,5 29 T1 4,2 11 CNTP5020 6,5 30 B3 4,0 12 CNTP5054 3,5 31 C5 4,5 13 CNTP5052 3,5 32 CF1 5,0 14 CNTP5053 3,5 33 CR1 4,5 15 CNTP5010 3,5 34 C2 4,0 16 CNTP5007 5,5 35 B2 4,0 17 CNTP5037 5,0 36 PDG 3,0 18 CNTP5002 5,5 37 LN 3,5 19 CNTP5012 3,5
Tiếp đó tiến hành sàng lọc với 7 chủng nấm mốc phân lập đƣợc (bảng 3.1) và 30 chủng A. niger thu nhận từ các bộ sƣu tập giống theo phƣơng pháp đo bán kính vòng thủy phân (bảng 3.2 và hình PL1.2) cho thấy có 19/37 chủng cho giá trị (D - d) ≥ 4mm (trong đó có 7 chủng tự phân lập và 12 chủng A. niger từ các bộ sƣu tập giống (chủng gạch chân)).
Bảng 3.3 Hoạt độ polygalacturonase của các chủng nấm mốc thử nghiệm
TT Chủng Hoạt độ PG (U/g môi trƣờng) TT Chủng Hoạt độ PG (U/g môi trƣờng) 1 CNTP5016 6,89 11 CĐN4 6,73 2 CNTP5007 13,64 12 BK01 6,86 3 CNTP5004 14,57 13 T1 4,59 4 CNTP5013 11,11 14 B1 5,29 5 CNTP5002 13,02 15 C1 2,95 6 CNTP5037 15,71 16 CF 15,09 7 CNTP5020 13,32 17 CR 5,83 8 CNTP5003 11,15 18 C2 14,71 9 CNTP5055 5,03 19 B2 3,82 10 CNTP5017 4,33
Từ kết quả đo hoạt độ polygalacturonase của 19 chủng đó (bảng 3.3) chọn đƣợc 7 chủng (chủng gạch chân) cho giá trị hoạt độ polygalacturonase trên 13 U/g môi trƣờng, trong đó chủng A. niger CNTP 5037 cho giá trị hoạt độ cao nhất (15,71 U/g môi trƣờng).
Abbasi H. và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger phân lập đƣợc trên môi trƣờng bã táo - cám lúa mỳ thu đƣợc hoạt độ polygalacturonase đạt 7,93 U/g cơ chất [9]. Maciel M.H.C. và cộng sự phân lập đƣợc chủng A. niger trên môi trƣờng rắn chứa phụ phẩm bã cọ (palm) thu đƣợc 66,19 U/g sau 4 ngày nuôi [72]. Akhter N. và cộng sự, nuôi trên môi trƣờng chứa 9,68% pectin và hàm ẩm 60% thu đƣợc 144,42 U/g [13].
Tiếp theo đó, sàng lọc 7 chủng nấm mốc lựa chọn ở phần trên qua khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase trên môi trƣờng lên men rắn (bảng 3.4).
Kết quả cho thấy trong số 7 chủng lên men trên môi trƣờng rắn sinh tổng hợp endopolygalacturonase, chọn đƣợc chủng A. niger CNTP 5037 sinh tổng hợp EPG với hoạt độ cao nhất 22,94 U/g môi trƣờng.
Bảng 3.4 Hoạt độ endopolygalacturonase của 7 chủng nấm mốc thử nghiệm
TT Chủng Hoạt độ endopolygalacturonase (U/g môi trƣờng) 1 CNTP 5037 22,94 2 CNTP 5004 18,61 3 CNTP 5007 17,30 4 CF 21,09 5 C2 20,79 6 CNTP 5002 16,88 7 CNTP 5020 16,45
Nhƣ vậy, từ 40 chủng nấm sợi và 30 chủng A. niger từ các bộ sƣu tập giống đã tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc A. niger CNTP 5037 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase 22,94 U/g môi trƣờng sau 3 ngày nuôi cấy.
3.1.2. Cải tạo chủng A. niger CNTP 5037 có khả năng sin tổng hợp EPG cao
Chủng A. niger CNTP 5037 trong điều kiện thí nghiệm chỉ tổng hợp endopolygalacturonase với hoạt độ thu đƣợc còn thấp. Để có thể thu nhận chủng có khả năng tổng hợp endopolygalacturonase cao hơn, chủng thử nghiệm đƣợc xử lí với tia tử ngoại ở điều kiện: UV 254 nm, công suất đèn 40W, khoảng cách chiếu xạ 20 cm.
Nhằm xác định thời gian chiếu xạ phù hợp để sàng lọc các đột biến [132], thời gian chiếu đƣợc tăng dần từ 0 – 80 phút [105]. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 và hình 3.2.
Kết quả cho thấy với thời gian chiếu UV 70 phút tỉ lệ sống chỉ còn 0,2% và chiếu 80 phút thì toàn bộ bào tử bị tiêu diệt. Tuy nhiên, theo Zambare V. và cộng sự, Hopwood D.A. và cộng sự tỷ lệ sống 0,01% là thích hợp nhất cho chọn lựa thời gian gây đột biến vì các vi sinh vật này có thể bị đột biến nhiều lần hoặc nhiều điểm dẫn tới tăng cƣờng khả năng sinh tổng hợp hoạt chất mong muốn khi nuôi cấy [50, 132]. Do đó, thời gian chiếu xạ 75 phút với tỉ lệ sống 0,02% đã đƣợc lựa chọn cho quá trình cải tạo chủng A. niger CNTP 5037 bằng tia UV.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của th i gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống của A. niger CNTP 5037
TT Thời gian chiếu xạ (phút) Số bào tử/ml Tỉ lệ sống (%)
1 0 90000 100 2 30 43568 48,40 3 40 17840 19,8 4 45 12240 13,68 5 50 10580 11,76 6 55 4080 4,53 7 60 2020 2,24 8 65 1160 1,29 9 70 180 0,20 10 75 20 0,02 11 80 0 0
n Khuẩn lạc A. niger CNTP 5037 với th i gian chiếu UV khác nhau
A – F: thời gian chiếu 30, 40, 50, 60, 70, 75 phút
A B C
3.1.2.1. Sàng lọc dòng đột biến sinh endopolygalacturonase cao
Bào tử chủng A. niger CNTP 5037 đƣợc chiếu UV với thời gian 75 phút sau đó trang trên môi trƣờng Czapeck-pectin chứa Triton X100, tiếp đó tách các khuẩn lạc và cấy chấm điểm các khuẩn lạc trên đĩa pettri chứa môi trƣờng Czapeck-pectin để xác định đƣờng kính vòng thủy phân.
Bảng 3.6 Khả năng tổng hợp endopolygalacturonase của chủng xử lý bằng UV
TT Ký hiệu dòng A. niger
Hoạt độ EPG (U/g)
Hiệu suất so với chủng gốc (%) 1 CNTP 5037 22,94 100,00 2 UV01 29,41 128,00 3 UV02 34,11 148,69 4 UV03 29,64 129,20 5 UV04 31,76 138,44 6 UV05 29,47 128,46 7 UV06 39,59 172,58 8 UV07 38,68 168,61 9 UV08 23,47 102,03 10 UV09 32,45 141,51 11 UV10 30,46 132,70 12 UV11 44,32 193,19 13 UV12 27,89 121,51 14 UV13 34,12 148,73 15 UV14 33,24 144,89 16 UV15 29,78 129,31 17 UV16 26,78 116,73 18 UV17 31,34 136,60 19 UV18 23,78 103,66 20 UV19 37,78 164,60 21 UV20 36,24 157,94
Qua 10 lần chiếu UV thu đƣợc 458 dòng có khả năng sống sót trên môi trƣờng Czapeck-pectin chứa Triton X100. Trong số 458 dòng này chỉ có 48 dòng cho giá trị D/d cao hơn chủng gốc A. niger CNTP 5037 (bảng PL1.1, phụ lục 1). Đặc biệt, lựa chọn đƣợc 20 dòng có D/d cao hơn (1,76 – 3,6 lần) so với chủng gốc cho quá trình sàng lọc tiếp theo.
Từ 20 dòng lựa chọn ở trên đƣợc tiếp tục tuyển chọn khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase trên môi trƣờng rắn. Sau 72 giờ nuôi cấy tiến hành thu và xác định hoạt độ enzyme. Kết quả thể hiện ở bảng 3.6 cho thấy, trong số 20 dòng có D/d cao hơn dòng tự nhiên (A. niger UV1 đến A. niger UV20) chỉ có 4 dòng có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao hơn từ 164,60% đến 193,19% so với dòng tự nhiên, bao gồm:
A. niger UV06, UV07, UV11, UV19. Sau quá trình cải biến, dòng A. niger có khả năng tổng hợp endopolygalacturonase hoạt độ cao hơn, từ 22,94 U/g ở dòng tự nhiên tăng lên 44,32 U/g ở dòng A. niger UV11. Tiếp đó 4 dòng này đƣợc lựa chọn và nuôi cấy qua nhiều lần cấy truyền để kiểm tra tính ổn định về khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase.
Bốn dòng A. niger UV06, UV07, UV11, UV19 đƣợc hoạt hóa, nuôi cấy trên môi trƣờng rắn và xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme của chúng qua 5 lần cấy truyền. Nhận thấy, chủng tự nhiên gần nhƣ ổn định qua 5 lần cấy truyền. Các dòng xử lý UV ở lần cấy truyền thứ 2 gần nhƣ không có sự thay đổi về hoạt độ nhƣng ở lần cấy truyền thứ 3 đã có sự suy giảm về khả năng sinh tổng hợp enzyme và càng về các lần cấy truyền sau sự suy giảm càng lớn. Trong bốn dòng chọn lựa có A. niger UV06 ổn định nhất, qua lần cấy truyền thứ 5 vẫn có khả năng tổng hợp enzyme đạt hiệu suất 95,57% so với lần cấy truyền đầu tiên (bảng 3.7). Do vậy, lựa chọn dòng A. niger UV06 cho nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.7 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của chủng cải tạo qua các lần cấy truyền
Tên chủng
Hoạt độ endopolygalacturonase (U/g) Số lần cấy truyền (lần) 1 2 3 4 5 A. niger CNTP 5037 22,04 22,17 22,06 21,53 21,01 A. niger UV06 39,59 39,41 39,01 38,76 37,84 A. niger UV07 38,68 38,47 30,25 26,8 21,39 A. niger UV11 44,32 39,81 32,94 28,56 26,01 A. niger UV19 37,78 37,31 36,94 35,78 35,51
3.1.2.2. Cải tạo chủng bằng kỹ thu t chiếu UV nhiều lần
Để tạo chủng xử lý bằng UV có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao hơn nữa, tiến hành xử lý bào tử của dòng A. niger UV06 nhiều lần bằng tia UV. Kết quả thu đƣợc biểu diễn ở bảng 3.8.
Bảng 3.8 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của dòng xử lý bằng UV nhiều lần qua các lần cấy truyền
Số lần chiếu
UV
Tên dòng
Hoạt độ endopolygalacturonase (U/g)
Số lần cấy truyền (lần) 1 2 3 4 5 2 A. niger UV06-12 45,19 45,41 44,01 44,76 44,84 A. niger UV06-13 48,68 42,47 40,15 36,51 31,14 A. niger UV06-14 54,32 40,01 32,94 18,16 6,09 A. niger UV06-15 47,78 32,13 26,62 15,18 5,58 3 A. niger UV06-12-21 64,06 60,21 54,38 52,22 50,37 A. niger UV06-12-22 57,43 47,12 35,92 25,18 14,25 A. niger UV06-12-23 60,82 59,22 59,85 58,02 58,15
Kết quả bảng 3.8 cho thấy sau khi xử lý UV lần 2 thu đƣợc dòng A. niger UV06-12 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao và ổn định trong khi hoạt độ enzyme từ dòng A. niger UV06-13, A. niger UV06-14 và A. niger UV06-15 cao hơn nhƣng không ổn định. Điều này có thể do các đột biến trên không bền và bị các cơ chế sửa chữa trong quá trình sinh trƣởng của A. niger đƣa về trạng thái giống nhƣ chủng gốc [103].
Tiến hành xử lý UV lần 3 với dòng A. niger UV06-12 và nhận đƣợc dòng A. niger
UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao gấp 2,8 lần so với chủng A. niger CNTP 5037 (60,82 U/g môi trƣờng), gấp 1,54 lần so với A. niger UV06 và ổn định qua 5 lần cấy truyền vẫn còn 58,15 U/g môi trƣờng.
Tiếp tục nghiên cứu sự ổn định của dòng A. niger UV06-12-23 qua nhiều lần cấy truyền nhằm ứng dụng dòng này trong sản xuất công nghiệp, kết quả thu đƣợc biểu diễn ở bảng 3.9. Dòng A. niger UV06-12-23 qua 15 lần cấy truyền vẫn giữ đƣợc 95% hoạt độ so với thế hệ đầu tiên. Kết quả thu đƣợc tƣơng tự nhƣ nghiên cứu tạo chủng đột biến có khả
năng sinh tổng hợp cellulase cao, Sangkharah K. và cộng sự tạo ra chủng đột biến bằng UV có khả năng sinh tổng hợp cellulase ổn định qua 12 lần cấy truyền [114], Fawzi E.M. tạo chủng đột biến ổn định qua 9 lần cấy truyền [38].
Bảng 3.9Khả năng sinh tổng hợp EPG của A. niger UV06-12-23 qua các lần cấy truyền
Số lần cấy truyền (lần) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hoạt độ EPG (U/g) 58,05 58,63 58,18 57,49 57,95 57,37 57,60 57,49 57,30 57,65
Nhƣ vậy, qua quá trình cải tạo chủng A. niger CNTP 5037 đã thu đƣợc dòng A. niger
UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao gấp 2,8 lần so với chủng gốc và ổn định qua nhiều lần cấy truyền. Kết quả đạt đƣợc cao hơn so với một số tác giả khác trên thế giới [12, 105]. Akbar S. và cộng sự đã sử dụng nhiều tác nhân đột biến nhƣ tia UV, colchicine, hydrogen peroxide, ethidium bromide nhằm cải thiện khả năng sinh tổng hợp pectinase của chủng A. carbonarius tạo đƣợc chủng E8 có khả năng sinh tổng hợp enzyme gấp 1,8 lần chủng tự nhiên [12].
3.1.3. Thu nhận và đặc tính của endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23
3.1.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp EPG
a. Ản ƣởng của àm lƣợng pectin
Pectin đóng vai trò là cơ chất cảm ứng cho quá trình tổng hợp endopolygalacturonase. Với phƣơng pháp lên men rắn, lƣợng pectin sử dụng đƣợc khảo sát trong khoảng 8 – 16% (w/w). Sau 3 ngày nuôi, hoạt độ endopolygalacturonase cao nhất đạt 65,78 U/g ở hàm lƣợng pectin 12% (w/w) (hình 3.3).
Kết quả nghiên cứu cũng tƣơng ứng với công bố của Akhter N. và cộng sự [13], Phutela U. và cộng sự [100]. Theo các tác giả này hoạt độ enzyme thu đƣợc cao nhất trong môi trƣờng rắn có bổ sung 12% cơ chất pectin.
Hình 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23
b. Độ dà môi trường
Độ dày môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger. Khi độ dày môi trƣờng nhỏ, nƣớc từ môi trƣờng sẽ bị bay hơi nhanh, không đảm bảo độ ẩm cho quá trình lên men. Ngƣợc lại, khi độ dày môi trƣờng quá lớn, tỷ lệ tƣơng đối giữa bề mặt tiếp xúc và khối lƣợng môi trƣờng nhỏ, độ lƣu thông – thoáng khí giảm, khả năng thoát nhiệt kém, ảnh hƣởng bất lợi tới quá trình sinh tổng hợp endopolygalacturonase. Từ kết quả hình 3.4 lựa chọn đƣợc độ dày môi trƣờng 17 mm (16 g môi trƣờng trong bình tam giác 250 ml) để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.4 Ảnh hưởng của độ dà m i trư ng đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23
c. Ản ưởng của độ ẩm môi trường
Độ ẩm môi trƣờng ban đầu có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật khi lên men rắn, do đó ảnh hƣởng tới sự sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cơ chất. Độ ẩm môi trƣờng sẽ thay đổi liên tục trong quá trình lên men, do vậy việc nghiên cứu độ ẩm cho môi trƣờng rất quan trọng. Độ ẩm thấp sẽ không đủ lƣợng nƣớc cho nấm sinh trƣởng, ngƣợc lại độ ẩm quá cao cũng ảnh hƣởng tiêu cực đến sự sinh trƣởng do độ thoáng khí giảm. Kết quả hình 3.5 cho thấy ở độ ẩm 60% chủng A. niger UV06-12-23 cho khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao nhất đạt 68,35 U/g. Giá trị hàm ẩm 60% cũng đƣợc xác định cho chủng A. niger IM-6 khi nuôi trên môi trƣờng rắn [13].
Hình 3.5 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của
A. niger UV06-12-23
d. Ản ưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật, mỗi vi sinh vật có thể sinh