3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.2.1. Lựa chọn nồng độ pectin
Tiến hành thủy phân pectin từ chanh leo với các nồng độ 1, 2, 3, 4 và 5% (w/v) trong thời gian 4 giờ. Tiến hành lấy mẫu sau mỗi 1 giờ để xác định hàm lƣợng POS. Kết quả thu đƣợc biểu diễn ở hình 3.19 cho thấy trong khoảng khảo sát, với cùng một lƣợng enzyme sử dụng (20 U/g) nhận thấy ở các nồng độ cơ chất thấp (1 và 2%) phản ứng diễn ra nhanh chóng, sản phẩm đạt cực đại chỉ sau 2 - 3 giờ. Khi tăng nồng độ cơ chất lên độ nhớt của dịch phản ứng tăng nhanh và vận tốc phản ứng cũng giảm xuống rõ rệt nhất là ở nồng độ 4 - 5%. Với nồng độ pectin 3% (w/v) tốc độ phản ứng đƣợc duy trì và ổn định trong khoảng 3 giờ, hàm lƣợng oligosaccharide ngày càng tăng lên (hình 3.20A). Phổ sản phẩm trên hình 3.20B cho thấy ở nồng độ 4 - 5% còn nhiều pectin chƣa đƣợc thủy phân.
Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; B: giếng 1-5 tƣơng ứng với nồng độ cơ chất 1, 2, 3, 4, 5%
Nồng độ pectin 3% (w/v) cũng đƣợc sử dụng trong quy trình sản xuất POS của Sáng chế Canada số CA 2428473. Pectin cam nồng độ 3% (30 g/l) đƣợc thủy phân bằng endopolygalacturonase của Pectinex PL (Amano), sản phẩm POS thu đƣợc chứa DP 2 – 10 chiếm 80,4% [22]. Nồng độ cơ chất 3% (w/v) đƣợc lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp với các lƣợng enzyme khác nhau nhằm tăng lƣợng POS tạo thành.
M 1 2 3 4 5 G2 G3 G1 B A
3.2.2.2. Tỷ lệ en me/cơ chất thích hợp
Tỷ lệ enzyme/cơ chất là một yếu tố vô cùng quan trọng, ảnh hƣởng lớn tới quá trình thủy phân. Cần lƣu ý rằng, với yêu cầu thủy phân giới hạn để tạo ra các oligosaccharide mong muốn, nên tỷ lệ enzyme/cơ chất đƣợc sử dụng để thủy phân phải đảm bảo yêu cầu quá trình hoạt động tốt nhƣng không thủy phân hoàn toàn pectin để tạo thành mono galacturonic acid.
Tiến hành thủy phân pectin vỏ chanh leo với nồng độ pectin 3% (w/v) trong đệm citrat pH 4,0. Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện trong 4 giờ có bổ sung endopolygalacturonase ở các tỷ lệ enzyme/cơ chất là 20 - 60 U/g pectin. Xác định hàm lƣợng POS tạo thành sau mỗi giờ và thành phần POS bằng sắc kí lớp mỏng (TLC). Kết quả đƣợc biểu diễn ở hình 3.21.
Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ en me/cơ chất đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; giếng 1-5 tƣơng ứng với tỷ lệ enzyme/cơ chất 20, 30, 40, 50, 60 U/g.
Thử nghiệm thủy phân ở nồng độ cơ chất 3% (w/v) cho thấy khi sử dụng tỷ lệ enzyme/cơ chất 20 và 30 U/g, lƣợng enzyme khá ít nên sau 4 giờ phản ứng vẫn còn nhiều pectin chƣa đƣợc thủy phân. Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ này lên tới 50 và 60 U/g, quá trình thủy phân xảy ra sâu hơn, phổ sản phẩm xuất hiện lƣợng đƣờng đơn (G1) khá nhiều (hình 3.21B). Ở tỷ lệ 40 U/g phổ sản phẩm chứa chủ yếu là đƣờng đôi, đƣờng ba và hàm lƣợng POS lớn nhất (hình 3.21A).
Tỷ lệ enzyme/cơ chất rất khác nhau đối với nguồn enzyme và đặc biệt với nguồn cơ chất khác nhau. Cơ chất là pectin củ cải đƣờng, Martini M. và cộng sự dùng polygalacturonase tỷ lệ 10 U/g và cellulase 0,725 U/g thu đƣợc 26,7 kg POS/100kg pectin
G1
G2
G3
M 1 2 3 4 5
[79]; với cơ chất pectin táo Nikolic M.V. và cộng sự dùng hỗn hợp enzyme polygalacturonase tỷ lệ 162 U/l và pectinase 27 U/l [91]; còn đối với pectin từ vỏ chanh Gomez B. và cộng sự báo cáo sử dụng Viscozyme L với hoạt độ polygalacturonase 5 U/g và thời gian thủy phân 24 giờ. Khi đó lƣợng POS thu đƣợc đạt 3,65 g/l [43].
Do vậy, với nguồn cơ chất pectin từ vỏ chanh leo và enzyme endopolygalacturonase lựa chọn tỷ lệ enzyme/cơ chất 40 U/g pectin cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân giới hạn pectin chanh leo nồng độ 3% (w/v) đƣợc thực hiện ở các giá trị nhiệt độ 40C, 50C và 60C. Sau khi dừng phản ứng thủy phân tiến hành xác định hàm lƣợng và thành phần của POS, kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.22.
Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; giếng 1-3 tƣơng ứng với nhiệt độ 40, 50, 60oC
Kết quả thí nghiệm cho thấy, ở nhiệt độ 40C tốc độ phản ứng thủy phân chậm (lƣợng G2 và G3 ít). Khi tăng nhiệt độ phản ứng lên 60C, lƣợng đƣờng đơn tạo ra quá nhiều. Trong khi phản ứng tiến hành ở 50C, dịch thủy phân đã xuất hiện lƣợng G2 và G3 mong muốn (hình 3.22B) và tổng lƣợng POS tạo ra cao nhất (hình 3.22A).
Nhƣ vậy, dù cả 3 mức nhiệt độ này đều nằm trong ngƣỡng nhiệt độ hoạt động của enzyme nhƣng hàm lƣợng sản phẩm POS thu đƣợc có nhiều sự khác biệt. So sánh với phần nghiên cứu điều kiện nhiệt độ thủy phân pectin nồng độ 1% (w/v) (hình PL3.1, phụ lục 3), nhận thấy có sự thay đổi về nhiệt độ thủy phân của hai nồng độ 1% và 3% (w/v). Với nồng độ pectin 1% (w/v), phản ứng thủy phân chỉ cần điều kiện là 40C trong khi đó với 3%
G1 G2 G3 B M 1 2 3 A
(w/v), ta phải nâng nhiệt độ thủy phân lên đến 50C. Nguyên nhân của sự sai khác này có thể đƣợc giải thích do ở nồng độ 3% (w/v), dịch thủy phân có độ nhớt cao hơn, nhiệt độ cao hơn sẽ giúp cho các polygalacturonic acid kéo giãn mạch, làm cho enzyme dễ dàng tham gia phản ứng tạo POS và 50oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme.
Nhiệt độ thủy phân 50oC cũng đƣợc sử dụng bởi một số báo cáo [15, 60, 67, 75, 91], do vậy lựa chọn nhiệt độ này cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.4. Ảnh hưởng của pH
Mỗi enzyme đều có khoảng pH tối ƣu khác nhau mà tại đó hoạt tính enzyme đạt cao nhất. Trong quá trình thủy phân pectin, enzyme chịu tác động của nhiệt độ, thời gian, pH dịch thủy phân thay đổi (do sản phẩm tạo thành có tính acid) và khuấy trộn cơ học… Vì vậy, nghiên cứu xác định pH tối ƣu cho quá trình thủy phân giới hạn pectin chanh leo tạo POS là công việc hết sức cần thiết.
Để xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân pectin chanh leo, tiến hành thủy phân pectin với các thông số: pectin nồng độ 3% (w/v), tỷ lệ enzyme/cơ chất 40 U/g, nhiệt độ phản ứng 50C, tốc độ khuấy 250 vòng/phút. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.23.
Hình 3.23Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; giếng 1 - 3 với pH 3, pH 4, pH 5
Với hình 3.23B thấy rằng thí nghiệm tiến hành ở mức pH 4 tƣơng ứng cho kết quả tốt nhất. Sản phẩm thủy phân đã xuất hiện các vệt G2 và G3 rất rõ. Đồng thời, lƣợng monogalacturonic acid tạo ra cũng ít hơn thí nghiệm ở pH 5 thể hiện ở vệt monogalacturonic (G1) mờ hơn. B G2 G3 G1 M 1 2 3 A B
Kết quả xác định hàm lƣợng oliosaccharide ở hình 3.23A cho kết quả tƣơng tự. Với các mức pH 4 và pH 5, lƣợng POS tạo thành tƣơng ứng là 16,43 mg/ml và 13,05 mg/ml. Trong khi đó với mức pH 3, lƣợng POS tạo thành chỉ là 10,07 mg/ml. Nhƣ vậy có thể thấy rõ, pH có ảnh hƣởng tới hiệu suất quá trình thủy phân pectin tạo POS và mức pH đƣợc lựa chọn là pH 4.
Kết quả nghiên cứu trên nguồn cơ chất pectin từ vỏ chanh leo và enzyme có hoạt tính endopolygalacturonase cũng nằm trong khoảng pH 4 – 5 của pH tối ƣu của enzyme nhƣ báo cáo của các tác giả khác. Bako K.B. và cộng sự, Kiss K. và cộng sự thủy phân giới hạn pectin bằng polygalacturonase ở pH 4.1 bằng đệm citrate [15, 60]. Gomez B. và cộng sự thủy phân pectin từ vỏ chanh tạo POS bằng Viscozyme L, pectinase 62 L và Pectinex Ultra SP-L ở pH 5 [43]. Nikolic M.V. và cộng sự thủy phân polygalacturonic acid bằng polygalacturonase và pectinase ở pH 4,5 thu đƣợc hàm lƣợng POS cao nhất [91]. Li S. và cộng sự báo cáo họ sử dụng endopolygalacturonase từ A. niger để thủy phân pectin từ quả sơn trà ở pH 3,5 trong 2 giờ thu đƣợc POS chủ yếu DP <11 [67].
3.2.2.5. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy
Do cơ chất pectin khi hòa tan trong đệm citrate pH 4,0 có độ nhớt cao. Điều này có ảnh hƣởng đến quá trình tiếp xúc của enzyme với cơ chất. Để ứng dụng quy trình sản xuất POS vào quy mô lớn cần nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện khuấy đến hiệu suất quá trình thủy phân.
Tiến hành thủy phân pectin với các thông số nhƣ sau: nồng độ pectin 3% (w/v) , tỷ lệ enzyme/cơ chất 40 U/g pectin, thủy phân trong đệm citrat pH 4,0, nhiệt độ 50C. Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện trong 4 giờ ở các tốc độ khuấy 200 – 350 vòng/phút. Kết quả đƣợc biểu diễn ở hình 3.24.
Dựa vào kết quả trên hình 3.24A nhận thấy rằng, với tốc độ khuấy 250 vòng/phút cho hiệu quả thủy phân rất tốt. Sau 4 giờ thủy phân, lƣợng POS thu đƣợc cao nhất, đạt đến 17,22 mg/ml. Trong khi đó, sau 4 giờ thủy phân, với tốc độ khuấy 200 vòng/phút chỉ thu đƣợc hàm lƣợng POS 11,97 mg/ml; 13,84 mg/ml và 11,04 mg/ml ở tốc độ khuấy 300 vòng/phút và 350 vòng/phút. Điều này có thể do tốc độ khuấy cao làm giảm khả năng tiếp xúc của endopolygalacturonase với cơ chất làm hiệu suất thủy phân giảm.
Hình 3.24 Ảnh hưởng của tốc độ khuấ đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; giếng 1-4 với tốc độ khuấy 200, 250, 300, 350 vòng/phút
Kết quả của sắc kí lớp mỏng (hình 3.24B) cho thấy rõ tác động của yếu tố tốc độ khuấy tới quá trình thủy phân. Ở đƣờng chạy ứng với tốc độ khuấy 200 vòng/phút, chƣa có sự phân tách thành các vạch rõ ràng, ở đƣờng chạy tƣơng ứng với thí nghiệm ở tốc độ khuấy 300 vòng/phút và 350 vòng/phút, sản phẩm tạo thành chủ yếu là monogalacturonic acid. Ở đƣờng chạy 250 vòng/phút, hình ảnh sản phẩm xuất hiện các vệt G2 và G3 đậm, vệt mono galacturonic acid không lớn và mờ hơn. Điều đó cho thấy với tốc độ khuấy này, sản phẩm thu đƣợc có hàm lƣợng oligosaccharide lớn. Tốc độ khuấy 250 vòng/phút đƣợc lựa chọn cho quá trình thủy phân pectin 3% (w/v) tạo POS.
Giá trị tốc độ khuấy theo nghiên cứu 250 vòng/phút là khá cao so với tốc độ khuấy các tác giả khác sử dụng để thủy phân pectin tạo POS 100 – 150 vòng/phút [15, 60, 91]. Tuy nhiên các tác giả này sử dụng nồng độ cơ chất 1% nên dịch cơ chất có độ nhớt thấp. Khi tăng nồng độ cơ chất lên 3% thì độ nhớt của dịch tăng lên do đó việc tăng tốc độ khuấy là việc cần thiết. Tốc độ khuấy thích hợp với nồng độ cơ chất pectin từ vỏ chanh leo 3% là 250 vòng/phút còn khá thấp so với công bố của Olano – Martin E. và cộng sự. Các tác giả này khi thủy phân pectin với nồng độ 3% đã tăng tốc độ khuấy lên 500 vòng/phút trong 80 phút thu đƣợc POS từ HMP và LMP [93].
3.2.2.6. Ảnh hưởng của th i gian
Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase đƣợc thực hiện trong 7 giờ. Xác định hàm lƣợng POS tạo thành ở các mốc thời gian khác nhau, kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện ở hình 3.25.
G2 G3 G1
M 1 2 3 4
Kết quả hình 3.25A cho thấy hàm lƣợng POS tăng nhanh và đạt cao nhất là 18,16 mg/ml khi thủy phân 4 tiếng, sau đó giảm dần. Điều này có thể do thời gian càng dài, enzyme thủy phân triệt để tạo thành monogalacturonic acid, nên lƣợng POS tạo thành giảm dần. Kết quả sắc ký (hình 3.25B) cũng cho kết quả tƣơng tự, tại đƣờng chạy tƣơng ứng với mẫu dịch thủy phân sau 4 giờ, pectin gần nhƣ đã đƣợc thủy phân hết, không còn các vệt kéo dài gần điểm chấm mẫu. Lƣợng monogalacturonic tạo thành cũng ít hơn so với mẫu của dịch thủy phân sau 5 giờ và 6 giờ.
Hình 3.25 Ảnh hưởng của th i gian đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; giếng 1-6 với thời gian thủy phân 1, 2, 3, 4, 5 và 6 giờ
Thời gian thủy phân giới hạn pectin tạo POS rất khác nhau (2 – 24 giờ) phụ thuộc vào nguồn cơ chất, tỷ lệ enzyme/cơ chất và thành phần oligosaccharide trong sản phẩm. Combo A.M.M. và cộng sự thu đƣợc POS gồm 18% Digalacturonic acid và 58% Trigalacturonic acid sau 2 giờ thủy phân polygalacturonic acid 0,2% bởi endopolygalacturonase [26]. Nilolic M.V. và cộng sự cần 12 giờ thủy phân 1% pectin táo bằng polygalacturonase 162 U/l và pectinase 27 U/l để thu POS chứa 28,4% trigalacturonic acid và cần 24 giờ để thu POS có DP <5 trong đó trigalacturonic acid chiếm 34,1% [91]. Tƣơng tự nhƣ trên Martinez M. và cộng sự mất 12,82 giờ để thủy phân pectin từ củ cải đƣờng bởi polygalacturonase 10 U/g [79]. Do đó với nồng độ cơ chất 3%, thời gian thủy phân 4 giờ sẽ thấp hơn nhiều so với các tác giả khác. Kết quả này có thể do tỷ lệ enzyme/cơ chất sử dụng cao hơn (40 U/g) nên hiệu quả thủy phân đƣợc tăng cƣờng dẫn đến rút ngắn đƣợc thời gian thủy phân.
G2 G3 G1 B M 1 2 3 4 5 6 A
Nhƣ vậy, sau khi thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo 3% (w/v) bởi lƣợng endopolygalacturonase 40 U/g pectin ở pH 4, nhiệt độ 50oC, tốc độ khuấy 250 vòng/phút và thời gian thủy phân 4 giờ lƣợng POS thu đƣợc 18,16 mg/ml dịch phản ứng.
3.2.2.7. Tối ưu h a các điều kiện thủy phân pectin tạo POS
Qua khảo sát nhận thấy nhiệt độ (X1), tỷ lệ enzyme/cơ chất (X2), tốc độ khuấy (X3) ảnh hƣởng mạnh đến quá trình thủy phân pectin tạo POS. Nghiên cứu ảnh hƣởng đồng thời của 3 yếu tố trên đƣợc xác định theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai để tối ƣu điều kiện thủy phân pectin tạo POS. Các điều kiện thí nghiệm và hàm lƣợng POS đƣợc thể hiện ở bảng 3.17.
Bảng 3.17 Ma tr n thực nghiệm quá trình thủy phân pectin tạo POS
TN Nhiệt độ (X1) (oC) Tỷ lệ enzyme/cơ chất (X2) (U/g) Tốc độ khuấy (X3) (vòng/phút) Hàm lƣợng POS (mg/ml) 1 45 30 250 14,03 2 55 30 250 16,15 3 45 50 250 11,57 4 55 50 250 21,60 5 45 40 200 13,81 6 55 40 200 19,89 7 45 40 300 16,82 8 55 40 300 20,20 9 50 30 200 18,06 10 50 50 200 14,98 11 50 30 300 15,20 12 50 50 300 22,06 13 50 40 250 24,10 14 50 40 250 24,19 15 50 40 250 23,18 16 50 40 250 24,06 17 50 40 250 23,68
Kết quả phân tích phƣơng sai của mô hình tối ƣu bằng phần mềm DX7.1.5 trình bày trong bảng 3.18 cho thấy cả 3 yếu tố tỷ lệ enzyme/cơ chất, tốc độ khuấy và nhiệt độ đều ảnh hƣởng mạnh đến quá trình thủy phân pectin tạo POS (giá trị p của X1, X2, X3
<0,05). Giá trị F của mô hình là 76,17 với p < 0,0001 (p<0,05) cho thấy dạng mô hình đã đƣợc lựa chọn đúng. Giá trị p của “Không tƣơng thích” là 0,25 (p>0,05) cho thấy mô hình này tƣơng hợp với thực nghiệm. Giá trị p của X1X2, X1X3 và X2X3 < 0,05 nên sự đồng tác động của nhiệt độ và tỷ lệ enzyme/cơ chất với tốc độ khuấy ảnh hƣởng mạnh tới quá trình thủy phân pectin tạo POS.
Phƣơng trình hồi quy biểu diễn hàm lƣợng POS (Y) mô tả ảnh hƣởng của các yếu tố nhƣ sau:
Y = +23,80 + 2,70*X1 + 0,85*X2 + 0,94*X3 + 1,98*X1*X2 - 0,68*X1*X3 + 2,48*X2*X3 - 3,95X12 - 4,05X22 - 2,21*X32.
Trong đó : nhiệt độ (X1), tỷ lệ enzyme/cơ chất (X2), tốc độ khuấy (X3)
Bảng 3.18 Kết quả ph n tích phương sai ANOVA của mô hình
Thông số Phƣơng sai Chuẩn F Mức có nghĩa p
Mô hình 308,27 76,17 <0,0001 X1 58,38 129,82 <0,0001 X2 5,73 12,74 0,0021 X3 7,09 15,76 0,0011 X1.X2 15,06 34,69 0,0001 X1.X3 1,80 4,01 0,0318 X2.X3 24,68 54,87 <0,0001 X12 73,51 163,48 <0,0001 X22 77,22 171,72 <0,0001 X32 25,09 55,79 <0,0001 Không tƣơng thích 1,08 0,70 0,2475