2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.3.Cải tạo chủng A niger sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao
Chủng A. niger CNTP 5037 đƣợc nuôi trên môi trƣờng Czapeck agar 3 ngày ở 30oC để thu bào tử. Pha loãng bào tử trong NaCl 0,9% đến nồng độ 9.104
bào tử/ml và đổ 10 ml vào đĩa petri Ф110 mm. Mở đĩa, đặt đĩa trên giá cách đèn UV 20 cm, chiếu đèn UV với thời gian 0 – 80 phút. Sau đó đặt dịch chứa bào tử trong tối 24 giờ. Hút 50 µl dịch bào tử vào đĩa petri chứa môi trƣờng Czapeck + 1% pectin + 0,1% triton X-100, trang đều. Nuôi trong tủ ấm 30oC trong 3 ngày và đếm số khuẩn lạc thu đƣợc, xác định tỷ lệ sống ở
các thời gian chiếu UV khác nhau. Chọn tỷ lệ sống < 0,1% và giữ đĩa petri tạo ngân hàng chủng xử lý bằng UV [125].
Tiếp đó tiến hành tuyển chọn dòng xử lý bằng UV thu đƣợc dựa trên khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao và ổn định [12, 116, 125].
Tuyển chọn dựa vào hoạt độ endopolygalacturonase
Các dòng nấm mốc xử lý bằng UV đƣợc hoạt hóa trên môi trƣờng Crapeck lỏng trong 3 ngày. Sau đó, nuôi cấy trên môi trƣờng sinh tổng hợp enzyme (môi trƣờng rắn) 3 ngày. Thu enzyme bằng đệm phosphate pH4,5 và xác định hoạt độ EPG. Dòng cho hoạt độ enzyme cao đƣợc lựa chọn để sàng lọc bƣớc tiếp theo.
Tuyển chọn dựa vào khả năng sinh tổng hợp enzyme ổn định
Tiến hành hoạt hóa và nuôi cấy nhiều lần: F2 đến F5 trên môi trƣờng rắn ở 30oC trong 72 giờ. Xác định hoạt độ và so sánh giữa các chủng để lựa chọn dòng cho hoạt độ enzyme ổn định qua nhiều lần cấy truyền.
Nghiên cứu tạo chủng xử lý bằng UV qua nhiều lần chiếu:
Dòng A. niger xử lý bằng UV ổn định chọn lựa ở bƣớc tuyển chọn trên đƣợc tiếp tục chiếu UV lần 2 và 3 với thời gian chiếu 75 phút ở khoảng cách 20 cm so với đèn UV. Sau mỗi lần chiếu tiến hành sàng lọc (dựa vào dòng cho hoạt độ enzyme cao) và xác định sự ổn định của dòng qua 5 lần cấy truyền.
2.2.1.4. ác định điều kiện nu i cấ sinh tổng hợp endopol galacturonase cao
Chủng A. niger UV06-12-23 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng Crapeck ở 30oC. Sau 3 ngày, cấp giống vào bình tam giác chứa cơ chất cám-trấu (tỷ lệ 7:2) với tỉ lệ 2.106 bào 3 ngày, cấp giống vào bình tam giác chứa cơ chất cám-trấu (tỷ lệ 7:2) với tỉ lệ 2.106 bào tử/g môi trƣờng.
Hàm lƣợng pectin: đƣợc khảo sát ở các nồng độ 8, 10, 12, 14, 16% (w/w) tƣơng ứng với độ ẩm 50%, sau 3 ngày nuôi ở 30o
C mẫu đƣợc đánh giá hoạt độ enzyme.
Độ dày môi trƣờng: đƣợc khảo sát ở các giá trị 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 mm (tƣơng đƣơng với 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24g môi trƣờng/bình 250ml). Độ ẩm môi trƣờng ban đầu giữ ở 50% và 12% pectin làm chất cảm ứng.
Độ ẩm môi trƣờng: đƣợc khảo sát ở các mốc 50, 60, 70, 80% (w/w) khi nuôi chủng thí nghiệm trong bình 250ml chứa 16g môi trƣờng có bổ sung 12% (w/w) pectin.
Nhiệt độ: đƣợc thử nghiệm với các mốc nhiệt độ 25, 30, 35, 40oC trong 16g môi trƣờng bổ sung 12% pectin và độ ẩm 60%.
Thời gian lên men: chủng đƣợc lên men theo các điều kiện thích hợp tìm đƣợc ở trên, định kì các khoảng thời gian 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày, mẫu canh trƣờng đƣợc xác định hoạt độ endopolygalacturonase [13, 39, 100].
2.2.1.5. ác định hoạt tính sinh học của POS
Nguyên tắc:
Hoạt tính prebiotic của một chất phản ánh khả năng hỗ trợ sự phát triển của một vi sinh vật nhất định so với các vi sinh vật khác và so với khả năng phát triển trên môi trƣờng không có hoạt tính prebiotic nhƣ glucose. Do đó, cacbohydrate có hoạt tính prebiotic nếu nó đƣợc chuyển hóa tƣơng tự nhƣ glucose bởi các chủng probiotic và đƣợc chọn lọc chuyển hóa bởi các chủng probiotic thay vì bởi các vi sinh vật đƣờng ruột khác [53].
Tiến hành:
Cấy 1% (v/v - 3x105 cfu/ml) canh trƣờng chứa các chủng thử nghiệm (nuôi riêng rẽ hoặc kết hợp) vào các ống nghiệm chứa môi trƣờng MR bổ sung 1% glucose (w/v) hoặc 1% POS (w/v). Nuôi ở 37oC. Cấy trang các mẫu canh trƣờng trên ở thời điểm ban đầu và sau 24 giờ vào môi trƣờng thạch đĩa để đếm số lƣợng khuẩn lạc (môi trƣờng thạch đĩa đặc hiệu VRBL, BSA, TSA, MRS đƣợc lựa chọn tƣơng ứng cho E. coli, S. typhi, S. aureus và
L. acidophilus). Điểm hoạt tính prebiotic (PAS - prebiotic activity score) đƣợc xác định theo công thức [53]:
2.2.1.6. ác định vi sinh v t tổng số hiếu khí: theo TCVN 9977: 2013
2.2.1.7. ác định Escherichia coli theo TCVN 9974: 2013
2.2.1.8. ác định Staphylococcus aureus theo TCVN 4830: 2005
2.2.1.9. ác định Salmonella theo TCVN 4829: 2005
2.2.1.10. Thử nghiệm độc tính cấp của pectic oligosaccharide
Thử nghiệm đƣợc tiến hành tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng trên 50 con chuột nhắt trắng giống Swiss với cân nặng 18 – 22 g. Tất cả chuột thử nghiệm đƣợc để ổn định 3 ngày trƣớc khi tiến hành thí nghiệm và theo dõi cân nặng trong quá trình thử nghiệm.
Tiến hành thử nghiệm sơ bộ trên 10 con chuột và chính thức trên 40 chuột, chia thành 4 nhóm gồm 1 nhóm đối chứng dùng nƣớc đun sôi để nguội và 3 nhóm thử nghiệm
theo mức liều đã dự tính. Các nhóm thử nghiệm đƣợc dùng các hỗn dịch thử ở các mức liều và số lần đƣa mẫu thử nhƣ bảng 2.3.
Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống, trong vòng 2 giờ, 24 giờ đầu và theo dõi hoạt động của động vật thí nghiệm trong thời gian 7 ngày sau khi uống.
Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp Nhóm chuột Liều dùng (ml hỗn dịch thử/20g chuột) Liều dùng (ml mẫu thử/kg chuột) Số chuột thí nghiệm Đối chứng 0,4 ml nƣớc x 3 lần ---- 10 Mức liều 1 0,4 ml hỗn dịch thử x 1 lần 20,0 g/kg chuột 10 Mức liều 2 0,4 ml hỗn dịch thử x 2 lần 40,0 g/kg chuột 10 Mức liều 3 0,4 ml hỗn dịch thử x 3 lần 60,0 g/kg chuột 10 2.2.2. P ƣơng p áp a l – sinh 2.2.2.1. Định lượng đư ng khử bằng DNS
Đƣờng khử đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Miller G.L. [84]. Bổ sung 1 ml thuốc thử DNS vào 0,2 ml mẫu đƣờng, đun sôi trong 10 phút, làm lạnh nhanh, đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 575 nm, dựa vào đồ thị đƣờng chuẩn Galacturonic acid suy ra hàm lƣợng galacturonic acid có trong mẫu.
2.2.2.2. ác định hàm lượng pectic oligosaccharide bằng Kit D-Galacturonic
Hàm lƣợng POS đƣợc xác định dựa trên sự thủy phân hoàn toàn POS bằng acid H2SO4 và đƣờng khử giải phóng ra (galacturonic acid) đƣợc xác định theo kit D- Galacturonic (Megazym, Ireland).
Tiến hành:
Bƣớc 1: Tiền xử lý mẫu
a. Tiền xử lý thu galacturonic acid tự do có trong mẫu:
- Mẫu dạng bột: đƣợc hòa tan trong nƣớc cất, vortex kỹ sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi
- Mẫu dạng dịch: đƣợc lấy trực tiếp đi đo D-galacturonic kit
b. Tiền xử lý mẫu, thủy phân hoàn toàn POS thành dạng monogalacturonic acid - Thêm 5 ml dung dịch H2SO4 vào mỗi ống và đậy nắp.
- Ủ ống ở 100˚C trong 6 giờ, lắc các ống trong suốt quá trình ủ.
- Chuyển dịch từ ống sang bình tam giác 100 ml, bổ sung nƣớc cất vào bình đến khi đạt vạch.
- Lắc đều dịch và ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. Bƣớc 2: Đo hàm lƣợng galacturonic acid có trong mẫu bằng D-galacturonic kit - Thành phần phản ứng đo hàm lƣợng galacturonic acid đƣợc trình bày ở bảng 2.4 - Sản phẩm phản ứng đƣợc đo ở bƣớc sóng hấp thụ 340 nm, nhiệt độ 25oC
Bảng 2.4 Thành phần và trình tự thí nghiệm định lượng galacturonic acid theo Kit D-galacturonic Chất Đối chứng Mẫu Nƣớc cất 2,10 ml 2 ml Mẫu - 0,10 ml Dung dịch 1 (đệm acetate) 0,20 ml 0,20 ml Dung dịch 2 (NAD+) 0, 20 ml 0,20 ml
Lắc đều, đo kết quả độ hấp thụ của các dung dịch (A1) sau khoảng 3 phút và bắt đầu phản ứng bằng cách bổ sung:
Dung dịch 3 (Enzyme) 0,02 ml 0,02 ml
Lắc đều, đo kết quả độ hấp thụ của các dung dịch (A2) khi phản ứng kết thúc (5 phút ở 37˚C).
Nồng độ của galacturonic acid đƣợc tính nhƣ sau:
Trong đó: V: thể tích cuối cùng (mL)
MW: khối lƣợng phân tử của D-galacturonic acid (g/mol) ε = hệ số phân hủy của NADH ở 340 nm = 6300 (l×mol-1
×cm-1) d = chiều dài đƣờng đi của ánh sáng (cm)
v = thể tích mẫu (mL)
Do đó: C galacturonic (g/l) = 0,7766 x ∆AD-galacturonic acid
Hàm lƣợng POS có trong mẫu nghiên cứu đƣợc tính bằng hàm lƣợng galacturonic acid giải phóng ra. Dựa trên lƣợng mẫu galacturonic acid chuẩn sẽ tính đƣợc hàm lƣợng POS có trong mẫu nghiên cứu theo công thức CPOS = Cgalacturonic x 0,9.
2.2.2.3. ác định hàm lượng pectic oligosaccharide bằng HPAEC
Dịch POS đƣợc pha loãng bằng nƣớc khử ion và lọc qua màng 0,2 µm. Tiến hành bơm 20 µl mẫu vào cột carbopac PA1 trên hệ thống Dionex (Detector điện hoá ED40, Bơm GP50, tiêm mẫu tự động Model 410, buồng cột L 5025 (Merck)). Pha động gồm dung dịch A (NaOH 100 mM), B (nƣớc deion), C (NaOH 100 mM và NaOAc 1 M), D (NaOH 100 mM và NaOAc 50 mM) tạo thành gradient 100% A từ 0 – 20 phút, từ 0 – 100% D trong 20 – 70 phút. Rửa cột trong 10 phút bằng 100% C và cân bằng 15 phút. Dung dịch chuẩn là monogalacturonic, digalacturonic và trigalacturonic acid với nồng độ 1 mg/ml [26].
2.2.2.4. ác định hoạt độ pol galacturonase
Hoạt độ polygalacturonase đƣợc xác định với cơ chất polygalacturonic acid. Phản ứng enzyme đƣợc thực hiện với 180 µl dung dịch polygalacturonic acid 1% (w/v) và 20 µl dung dịch enzyme (đƣợc pha loãng tới nồng độ thích hợp), ở 50oC trong 10 phút. Dừng phản ứng bằng 1 ml dung dịch DNS và đun sôi trong 10 phút. Tiếp đến, li tâm hỗn dịch phản ứng ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút (cho loại cặn nếu có). Đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 575 nm. Dựa vào đồ thị đƣờng chuẩn acid galacturonic với thuốc thử DNS để xác định hoạt độ enzyme.
Một đơn vị hoạt độ polygalacturonase là lƣợng enzyme cần thiết để xúc tác chuyển hóa acid polygalacturonic tạo thành 1 µmol acid galacturonic trong thời gian 1 phút ở những điều kiện hoạt động thích hợp của enzyme [15, 60].
2.2.2.5. ác định hoạt độ endopol galacturonase
Phản ứng enzyme đƣợc thực hiện với 1ml dung dịch pectin 3% và 250µl dung dịch enzyme ở 50⁰C. Độ giảm độ nhớt của dung dịch thủy phân pectin đƣợc xác định với nhớt kế Elcometer (Model 2300RV, Mỹ), tốc độ quay 200 vòng/phút, trục L2 trong thời gian 30 phút.
Một đơn vị endopolygalacturonase là lƣợng enzyme cần thiết làm giảm 50% độ nhớt của dung dịch trong 30 phút ở 50oC và pH 4,5 [9, 39, 47].
2.2.2.6. ác định hàm lượng protein
Lấy 100 µl dung dịch protein có độ pha loãng thích hợp đƣợc bổ sung vào 900µl dung dịch Bradford. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó đo mật độ quang ở bƣớc sóng 595 nm với đối chứng là hỗn dịch phản ứng giữa nƣớc cất với thuốc thử Bradford. Dựa vào đồ thị chuẩn BSA để tính hàm lƣợng protein [16].
2.2.2.7. Tinh sạch endopolygalacturonase
Dịch enzyme đƣợc chiết tách bằng đệm phosphate pH 4,5 (tỷ lệ chiết đệm: môi trƣờng nuôi là 7:1) trên máy lắc 200 vòng/phút trong 2 giờ, lọc qua vải màn sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No1. Dịch sau khi lọc đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 20 phút ở 4o
C và thu dịch nổi (enzyme thô) [18, 59].
Kết tủa endopolygalacturonase Kết tủa bằng (NH4)2SO4
Dịch enzyme sau khi ly tâm đƣợc kết tủa bằng (NH4)2SO4. Bổ sung ammonium sulfate trong điều kiện khuấy trong bể đá và giữ ở 4o
C một cách từ từ cho tới khi đạt tới các nồng độ bão hòa mong muốn (40 - 80%). Thu kết tủa enzyme bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC. Kết tủa thu đƣợc sau đó đƣợc hòa tan trong đệm natri citrat (0,1M, pH 4,5). Loại muối của dịch hòa tan kết tủa trên bằng túi thẩm tích cho tới khi muối đƣợc loại bỏ hoàn toàn (thử bằng BaCl2), sau đó xác định hoạt độ EPG [115].
Kết tủa bằng ethanol
Dịch enzyme sau khi ly tâm đƣợc bổ sung ethanol lạnh (0oC) sao cho đạt nồng độ 50%, 60%, 70% và 80%, để dịch ổn định 2 tiếng ở 0 – 4oC, sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C. Hòa tan kết tủa trong đệm pH 4,5 và xác định hoạt độ EPG.
Thu endopolygalacturonase bằng phƣơng pháp lọc dòng ngang
Dịch enzyme thô đƣợc lọc bằng hệ thống lọc QuixStand Benchop (Hãng Amersham Bioscience) với bộ lọc 10kDa. Tốc độ bơm mẫu đầu vào 100 rpm và điều chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt màng không vƣợt quá 25 psi. Chú ý duy trì nhiệt độ là 4oC trong suốt quá trình lọc để tránh vô hoạt enzyme. Thu dịch qua màng lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme cũng nhƣ hoạt độ enzyme tƣơng ứng [18].
Tinh sạch endopolygalacturonase bằng sắc ký trao đổi ion trên hệ thống FPLC Mẫu thí nghiệm đƣợc chạy trên hệ thống FPLC, Amersham Pharmacia GE (Mỹ) với cột Q – sepharose fast flow (QFF). Thông số cột nhƣ sau:
Thể tích cột: 1ml.
Khả năng trao đổi ion trên gel: 0,11 – 0,16 mmol Cl-/ml Khả năng gắn lƣợng protein trong dịch chạy: 110 mg HAS/ml
Cột đƣợc tái sinh và cân bằng với đệm Tris – HCl 50mM pH 7,2 (đệm A), sau khi cột cân bằng mẫu đƣợc đƣa lên cột với tốc độ 1 ml/phút, protein enzyme sẽ đƣợc giữ lại trên cột. Dùng đệm A rửa cột để loại các protein không bám vào hạt gel. Sau đó dùng NaCl 1M chạy gradient nồng độ 0 – 500 mM để thôi protein bám trên cột với tốc độ dòng 1 ml/phút. Thu 1,5 ml/phân đoạn và tiến hành xác định hoạt tính [18].
2.2.2.8. Điện di protein
Điện di trên gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Laemmli U.K. [64]. Mẫu đƣợc phân tách trên gel polyacrylamide 12,5 % (w/v), 16 mA trong 1,5 giờ. Protein đƣợc nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue G-250.
2.2.2.9. hảo sát đặc tính của endopol galacturonase
Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ
Nhiệt độ tối ƣu của enzyme đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp xác định hoạt độ EPG ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 30 - 70oC. Để khảo sát độ bền nhiệt, enzyme đƣợc ủ trƣớc trong dung dịch đệm citrate photphat 0,1M pH 4,5 ở các nhiệt độ khác nhau (trong khoảng từ 30 - 70oC). Sau những khoảng thời gian 1 – 7 giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ endopolygalacturonase còn lại.
Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzyme đƣợc xác định ở nhiệt độ tối ƣu của enzyme với cơ chất đƣợc pha trong dung dịch đệm citrate photphat 0,1M có các giá trị pH khác nhau nằm trong khoảng từ pH 3,0 đến 7,0. Để khảo sát độ bền pH, enzyme đƣợc pha loãng và ủ ở 40oC với dung dịch đệm trên có các giá trị pH khác nhau, sau những khoảng thời gian 1 – 6 giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ endopolygalacturonase còn lại (với cơ chất đƣợc pha trong dung dịch đệm pH 4,5) [85, 115].
Ảnh hƣởng của ion đến hoạt tính enzyme đƣợc nghiên cứu bằng cách ủ dung dịch enzyme với các ion kim loại Ca2+
, Na+, K+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+ (nồng độ cuối 10 mM) trong đệm cictrate photphat 0,1M (pH 4,5) ở 50oC trong 10 phút, sau đó xác định hoạt độ endopolygalacturonase còn lại và so sánh với mẫu không bổ sung ion kim loại (đối chứng).
Xác định Km và Vmax
Km và Vmax đƣợc xác định theo thực nghiệm bằng cách đo vận tốc phản ứng ở một số nồng độ cơ chất khác nhau: 1 – 6 mg/ml, sau đó vẽ đồ thị để tính Km và Vmax.
Trong đó: S: Nồng độ cơ chất (mg/ml)
Km: Hằng số Michaelis-Menten (mg/ml) Vmax: Vận tốc cực đại (µmol/phút/mg) V: vận tốc phản ứng (µmol/phút/mg) v = 1 Vmax .S + Km Vmax 1 v = Km Vmax 1 S + 1 Vmax S
Vẽ đồ thị theo phƣơng trình Michaelis – Menten bằng phần mềm SigmaPlot và xác định Km, Vmax với các giá trị thực nghiệm của nồng độ cơ chất và vận tốc phản ứng tƣơng ứng. Vận tốc phản ứng của endopolygalacturonase đƣợc biểu diễn bằng lƣợng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lƣợng sản phẩm đƣợc tạo thành trong một đơn vị thời gian [18].
2.2.2.10. Phương pháp thu pectin từ vỏ chanh leo
Vỏ chanh leo rửa sạch, cắt nhỏ và chần bằng dung dịch axit citric 5% trong 3 phút rồi nghiền mịn. Sau đó bổ sung nƣớc theo tỉ lệ 1kg vỏ : 3 kg nƣớc và bổ sung acid citric tới