3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.3. Thu nhận và đặc tính của endopolygalacturonase từ A niger UV06-12-23
3.1.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp EPG
a. Ản ƣởng của àm lƣợng pectin
Pectin đóng vai trò là cơ chất cảm ứng cho quá trình tổng hợp endopolygalacturonase. Với phƣơng pháp lên men rắn, lƣợng pectin sử dụng đƣợc khảo sát trong khoảng 8 – 16% (w/w). Sau 3 ngày nuôi, hoạt độ endopolygalacturonase cao nhất đạt 65,78 U/g ở hàm lƣợng pectin 12% (w/w) (hình 3.3).
Kết quả nghiên cứu cũng tƣơng ứng với công bố của Akhter N. và cộng sự [13], Phutela U. và cộng sự [100]. Theo các tác giả này hoạt độ enzyme thu đƣợc cao nhất trong môi trƣờng rắn có bổ sung 12% cơ chất pectin.
Hình 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23
b. Độ dà môi trường
Độ dày môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger. Khi độ dày môi trƣờng nhỏ, nƣớc từ môi trƣờng sẽ bị bay hơi nhanh, không đảm bảo độ ẩm cho quá trình lên men. Ngƣợc lại, khi độ dày môi trƣờng quá lớn, tỷ lệ tƣơng đối giữa bề mặt tiếp xúc và khối lƣợng môi trƣờng nhỏ, độ lƣu thông – thoáng khí giảm, khả năng thoát nhiệt kém, ảnh hƣởng bất lợi tới quá trình sinh tổng hợp endopolygalacturonase. Từ kết quả hình 3.4 lựa chọn đƣợc độ dày môi trƣờng 17 mm (16 g môi trƣờng trong bình tam giác 250 ml) để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.4 Ảnh hưởng của độ dà m i trư ng đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23
c. Ản ưởng của độ ẩm môi trường
Độ ẩm môi trƣờng ban đầu có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật khi lên men rắn, do đó ảnh hƣởng tới sự sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cơ chất. Độ ẩm môi trƣờng sẽ thay đổi liên tục trong quá trình lên men, do vậy việc nghiên cứu độ ẩm cho môi trƣờng rất quan trọng. Độ ẩm thấp sẽ không đủ lƣợng nƣớc cho nấm sinh trƣởng, ngƣợc lại độ ẩm quá cao cũng ảnh hƣởng tiêu cực đến sự sinh trƣởng do độ thoáng khí giảm. Kết quả hình 3.5 cho thấy ở độ ẩm 60% chủng A. niger UV06-12-23 cho khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao nhất đạt 68,35 U/g. Giá trị hàm ẩm 60% cũng đƣợc xác định cho chủng A. niger IM-6 khi nuôi trên môi trƣờng rắn [13].
Hình 3.5 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của
A. niger UV06-12-23
d. Ản ưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật, mỗi vi sinh vật có thể sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme mục tiêu trong một phạm vi nhất định. Mặc dù, A. niger là chủng nấm mốc hoạt động trong vùng nhiệt độ ƣa ấm khoảng 20 – 40oC nhƣng qua nghiên cứu tài liệu cho thấy nhiệt độ sinh tổng hợp endopolygalacturonase của các chủng A. niger
rất khác nhau. Kiran R.R.S. và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger GHRM5 ở 30oC cho sinh tổng hợp endopolygalacturonase [59], trong khi đó Akhter N. và cộng sự lại chọn 40oC cho nuôi cấy A. niger IM-6 [13], Zhou H. và cộng sự nuôi cấy A. niger GJ-2 ở 37oC [134].
Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của chủng
A. niger UV06-12-23 đƣợc thực hiện trong khoảng 20 - 40oC. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6 cho thấy ở nhiệt độ 30oC A. niger UV06-12-23 phát triển mạnh nhất và cũng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao nhất (69,13 U/g). Do đó lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 30oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23
e. Ản ƣởng của thời gian
Thời gian lên men có ảnh hƣởng lớn trong sản xuất enzyme. Thời gian lên men để đạt hoạt độ endopolygalacturonase cao nhất càng ngắn thì chi phí sản xuất càng thấp. Kết quả hình 3.7 cho thấy chủng A. niger UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao nhất 70,05 U/g sau 72 giờ. Kết quả của Fontana R.C. và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger trên môi trƣờng rắn chứa nguồn pectin cam cũng cho hoạt độ polygalacturonase cao nhất sau 72 giờ [39]. Do vậy lựa chọn thời gian nuôi cấy 72 giờ để thu nhận enzyme A. niger UV06-12-23.
Hình 3.7 Ảnh hưởng của th i gian nu i đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23
Từ kết quả khảo sát cho thấy 3 thông số hàm lƣợng pectin, hàm ẩm và nhiệt độ ảnh hƣởng đáng kể đến hoạt độ endopolygalacturonase. Với hàm lƣợng pectin 12%, độ dày môi
trƣờng 17 mm, độ ẩm 60% và nhiệt độ 30o
C hoạt độ enopolygalacturonase thu đƣợc cao nhất sau 72 giờ lên men.
3.1.3.2. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23
Mục đích của quá trình này là tìm sự tƣơng tác đồng thời của các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh tổng hợp endopolygalacturonase để lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho chủng A. niger UV06-12-23 đạt hoạt độ endopolygalacturonase cao nhất.
Dựa trên cơ sở đã khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp enzyme, tiến hành xác định ảnh hƣởng đồng thời của 3 yếu tố: hàm lƣợng pectin, hàm ẩm, nhiệt độ. Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.10 cho thấy sau 72 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng rắn, hoạt độ endopolygalacturonase thu đƣợc từ chủng A. niger UV06-12-23 nằm trong khoảng 51,71 - 73,29 U/g, tƣơng ứng với các thí nghiệm số 3 và số 17.
Kết quả phân tích phƣơng sai của mô hình tối ƣu bằng phần mềm DX7.1.5 (State- Ease) trình bày trong bảng 3.11 cũng cho thấy yếu tố độ ẩm và nhiệt độ ảnh hƣởng mạnh đến quá trình sinh tổng hợp enzyme. Giá trị F của mô hình là 45,52 với p < 0,0001 (p<0,05) cho thấy dạng mô hình đã đƣợc lựa chọn đúng. Giá trị p của “Không tƣơng thích” là 0,3620 (p>0,05) cho thấy mô hình này tƣơng hợp với thực nghiệm.
Phƣơng trình hồi quy biểu hiện hoạt độ enzyme mô tả ảnh hƣởng của các yếu tố độc lập và các mối tƣơng tác giữa chúng đƣợc biểu diễn nhƣ sau:
Hoạt độ EPG = +72,02 + 4,53X1 + 1,55X2 + 2,61X3 + 3,40X1X2 – 2,00X1X3 + 3,13X2X3 – 6,91X12 – 7,04 X22 – 2,53X32
.
Bảng 3.10 Ma tr n thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hoạt độ EPG thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau
TN Độ ẩm (%) Hàm lƣợng pectin (%) Nhiệt độ (oC) Hoạt độ EPG (U/g) 1 50 10 30 54,42 2 70 10 30 58,28 3 50 14 30 51,05 4 70 14 30 68,53 5 50 12 30 53,71 6 70 12 25 65,17 7 50 12 35 64,00 8 70 12 35 67,45 9 60 10 25 62,13 10 60 14 25 58,64 11 60 10 35 60,02 12 60 14 35 69,03 13 60 12 30 70,05 14 60 12 30 72,21 15 60 12 30 73,17 16 60 12 30 71,38 17 60 12 30 73,29
Bảng 3.11 Kết quả ph n tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX7.1.5
Thông số Tổng p ƣơng sai Chuẩn F Mức c ng ĩa p
Mô hình 817,94 45,52 <0,0001 X1 X2 X3 X1X2 X1X3 164,26 19,22 54,34 46,38 16,04 76,85 8,99 25,42 21,70 7,50 <0,0001 0,0200 0,0015 0,0023 0,0289 X2X3 39,06 18,28 0,0037 X12 X22 X32 Không tƣơng thích 201,12 208,61 26,87 7,70 94,09 97,60 12,57 1,41 <0,0001 <0,0001 0,0094 0,3620
Sử dụng phƣơng pháp hàm kỳ vọng để tối ƣu hóa hoạt độ EPG thu đƣợc sau quá trình nuôi cấy bằng phần mềm Design-Expert. Kết quả tìm đƣợc 43 phƣơng án thí nghiệm trong đó phƣơng án tốt nhất để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: độ ẩm 64%, hàm lƣợng pectin 12,5% và nhiệt độ 31oC. Khi đó, hoạt độ EPG đạt đƣợc trong các điều kiện trên theo tính toán là 73,4 U/g (hình 3.8).
Thực nghiệm nuôi cấy A. niger UV06-12-23 trên môi trƣờng rắn tại điều kiện tối ƣu (độ ẩm 64%, pectin 12,5%, 31o
C) sau 3 ngày thu đƣợc hoạt độ EPG 73,15 U/g, kết quả này có độ tƣơng thích cao so với lý thuyết.
Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp endopolygalacturonase của chủng A. niger UV06-12-23 là 31oC, hàm lƣợng pectin 12,5%, độ ẩm là 64%. Hoạt độ enzyme đạt 73,15 U/g sau 72 giờ nuôi.
Dƣới điều kiện tối ƣu cho lên men rắn chủng đột biến A. niger GHRM5 sinh tổng hợp EPG với hoạt độ 42,66 U/g [59]. Theo Maciel M.H.C. và cộng sự, hoạt độ endopolygalacturonase cao nhất đạt 66,19 U/g sau 96 giờ lên men [72]. Trong khi đó, Hendges D.H. và cộng sự báo cáo chỉ tổng hợp đƣợc endopolygalacturonase từ A. niger
T0005/007-2 với hoạt độ 45 U/g trên môi trƣờng lên men rắn ở độ dày môi trƣờng 170 mm sau 92 giờ lên men [47], từ chủng đột biến A. sojae M3 chỉ tổng hợp đƣợc 35 U/g [30].
3.1.3.3. Tách và tinh sạch endopolygalacturonase từ chủng A. niger UV06-12-23
Bằng phƣơng pháp kết tủa và lọc dòng ngang
Endopolygalacturonase sau khi lên men rắn đƣợc chiết bằng đệm citrate pH 4,0 và kết tủa bằng muối ammonium sulfate 85% độ bão hòa, ethanol 70% lạnh (0oC) và lọc dòng ngang màng 10 kDa [27]. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi enzyme đƣợc biểu diễn trên hình 3.9.
Hình 3.9 Ảnh hưởng của phương pháp thu nh n đến hiệu suất thu hồi EPG
Nghiên cứu cụ thể từng tác nhân kết tủa và thu nhận EPG đƣợc biểu diễn ở bảng PL2.1 - 2.3 (phụ lục 2). Tuy nhiên, khi so sánh ba phƣơng pháp thu nhận enzyme kỹ thuật với nhau, cho thấy hiệu suất thu hồi enzyme bằng kĩ thuật lọc cao hơn hẳn so với kết tủa bằng amonium sulfate bão hòa và ethanol. Hiệu suất thu EPG giảm khi sử dụng tác nhân kết tủa có thể bởi nguyên nhân do bị thất thoát enzyme ở nồng độ muối thấp (amonium sulfate bão hòa) và enzyme bị biến tính bởi tác nhân hữu cơ (ethanol). Đối với lọc, quá trình diễn ra trong thời gian ngắn hơn và luôn đƣợc đảm bảo trong điều kiện nhiệt độ là
4oC nên enzyme ít bị biến tính hơn. Nhƣ vậy, phƣơng pháp lọc màng đƣợc lựa chọn để thu nhận EPG sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion
Các phƣơng pháp sắc ký thƣờng đƣợc sử dụng cho tinh sạch EPG là sắc ký trao đổi ion [17, 40, 57, 113], sắc ký lọc gel để tinh sạch lần 2 với gel Sephadex G75 và Sephadex G 100 cho tinh sạch enzyme từ A. niger SA6 [18] và A. foetidus MTCC 10367 [99]. Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp làm sạch EPG bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion trên cột Q-sepharose fast flow (cột QFF) trên hệ thống FPLC đƣợc lựa chọn.
Dịch enzyme thu đƣợc sau 72 giờ lên men chủng A. niger UV06-12-23 đƣợc lọc cut-off qua màng 10kDa và cô đặc 10 lần. Tiến hành chạy sắc ký trao đổi ion cột QFF trên hệ thống FPLC. Cột đƣợc cân bằng với đệm Tris – HCl 50mM pH 7,2, đệm đẩy là gradient NaCl 0 – 500 mM, tốc độ đẩy enzyme là 1ml/phút. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.10 và bảng 3.12.
Bảng 3.12 Hoạt độ EPG tại các ph n đoạn tương ứng với đỉnh thu được khi tinh sạch
Phân đoạn 30 - 35 36 - 40 41 - 42
Hoạt độ EPG (U/ml) 850,0 47,2 0
Qua hình 3.10 cho thấy trên sắc ký đồ chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất tƣơng ứng với hoạt độ enzyme tại phân đoạn 30 – 35 có hoạt độ cao nhất 850 U/ml (bảng 3.12), tiến hành xác định hoạt độ endopolygalacturonase là 794,4 U/mgPr. Để kiểm tra độ tinh sạch của protein enzyme, tiến hành điện di SDS-PAGE.
Hình 3.10 Sắc ký đồ tinh sạch EPG bằng cột Q-sepharose FF trên hệ thống FPLC
Kết quả hình 3.11 cho thấy khi chạy điện di, sản phẩm protein enzyme xuất hiện một băng khá đậm có kích thƣớc xấp xỉ 60 kDa và sản phẩm enzyme tƣơng đối tinh sạch. Một số các báo cáo khác cho thấy đã tách đƣợc endopolygalacturonase từ A. niger cũng nằm trong khoảng kích thƣớc này [56].
Hình 3.11 Kết quả điện di SDS-PAGE protein endopolygalacturonase
M: marker protein (Fermentas), 1: dịch enzyme thô, 2: dịch enzyme sau lọc cut-off 10 kDa, 3: dịch enzyme sau cột QFF
Phân tích về mức độ làm sạch và hiệu suất thu hồi cho thấy chế phẩm endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23 sau khi qua cột QFF có hoạt độ riêng 794,4 U/mgPr với độ tinh sạch 6,38 lần so với endopolygalacturonase trong dịch thô và hiệu suất thu hồi đạt 38,8% (bảng 3.13). Kết quả đạt đƣợc cũng khá tƣơng đồng với công bố của Buga M.L. và cộng sự khi tinh sạch EPG từ A. niger SA6 bằng sắc ký trao đổi ion thu đƣợc enzyme có độ tinh sạch 3,72 lần và tỷ lệ thu hồi 8,1% [18].
Bảng 3.13 Các bước tinh sạch EPG từ A. niger UV06-12-23
TT Các bƣớc tinh sạch Thể tích (ml) Lƣợng protein tổng số (mg) Hoạt độ tổng (U) Hoạt độ riêng (U/mgPr) Mức độ tinh sạch (lần) Hiệu suất thu hồi (%) 1 Dịch enzyme thô 1000 87,9 10950 124,6 1,00 100 2 Sau lọc cut-off 100 37,75 9187 243,4 1,95 83,9 3 Sau khi qua cột
Q-sepharose
5 5,35 4250 794,4 6,38 38,8
3.1.3.4. Đặc tính của endopolygalacturonase từ chủng A. niger UV06-12-23
a. Ản ƣởng của p đến hoạt tín và độ bền enzyme
pH ảnh hƣởng rất rõ rệt đến phản ứng enzyme vì pH ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa cơ chất và độ bền của enzyme. Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính EPG của A. niger UV06-12-23 qua đó xác định đƣợc pH tối ƣu của enzyme.
pH tối ƣu của EPG từ A. niger UV06-12-23
Để xác định pH tối ƣu, endopolygalacturonase của chủng A. niger UV06-12-23 đƣợc phản ứng với cơ chất polygalacturonic acid trong đệm ở các pH khác nhau, ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 10 phút. Mối quan hệ giữa pH và hoạt độ tƣơng đối của enzyme thu đƣợc thể hiện ở hình 3.12.
Kết quả hình 3.12 cho thấy tƣơng tự nhƣ đặc tính của endopolygalacturonase từ chủng gốc A. niger CNTP 5037, enzyme từ chủng xử lý bằng UV hoạt động thích hợp trong vùng pH acid từ 4 – 5 và hoạt độ enzyme thu đƣợc cao nhất ở pH 4,5. Ở pH này, hoạt tính của EPG là tối đa và sự thay đổi pH cao hơn hoặc thấp hơn đều làm hạ thấp đáng kể độ hoạt động của enzyme.
Hình 3.12Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23
Một số tác giả khi nghiên cứu đặc tính của EPG từ A. niger cũng tìm đƣợc dải pH thích hợp cho hoạt tính polygalacturonase nằm trong khoảng từ 3,5 - 5,5 và pH tối ƣu là 4,5 – 5 [27, 33, 36].
Xác định độ bền pH
Khảo sát độ bền pH đến hoạt tính endopolygalacturonase bằng cách ủ enzyme ở 40oC trong dung dịch đệm pH từ 3 - 6, sau những khoảng thời gian khác nhau, lấy mẫu xác định hoạt độ endopolygalacturonase còn lại (với cơ chất đƣợc pha trong dung dịch đệm pH 4,0). Kết quả thu đƣợc thể hiện ở đồ thị hình 3.13.
Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23 (A) và A. niger CNTP5037 (B)
Kết quả cho thấy EPG từ chủng xử lý UV bền trong vùng pH 3 – 5 (hình 3.13A) và tƣơng tự nhƣ enzyme từ chủng gốc A. niger CNTP5037 (hình 3.13B). Sau 6 giờ ủ ở 40oC trong đệm pH 4; 4,5 và 5 hoạt độ enzyme vẫn còn giữ hơn 60% so với ban đầu. Ở pH 7 hoạt độ enzyme chỉ còn lại 15,5% sau 6 giờ. Mohsen S.M. và cộng sự báo cáo endopolygalacturonase từ chủng A. niger U – 86 hoạt động ổn định ở pH 3 – 6 và độ bền giảm ngoài khoảng pH này [85].
b. Ản ƣởng của nhiệt độ đến hoạt tín và độ bền enzyme
Nhiệt độ tối ƣu của EPG từ A. niger UV06-12-23
Mỗi enzyme đều có một giá trị nhiệt độ tối ƣu mà ở đó hoạt tính của nó đƣợc thể hiện mạnh nhất cũng nhƣ có vùng nhiệt độ mà ở đó hoạt tính enzyme ít bị ảnh hƣởng nhất