3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.1. Hoạt tính sinh học
Để minh chứng tác dụng có lợi của pectic oligosaccharide, trong nghiên cứu này đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm POS trong điều kiện in vitro thông qua khả năng làm tăng số lƣợng vi khuẩn có lợi và giảm số lƣợng vi khuẩn gây hại trên các chủng kiểm định. Bên cạnh đó, điểm hoạt tính prebiotic (PAS) của POS cũng đƣợc đánh giá và so sánh với một số loại prebiotic khác đang đƣợc sử dụng phổ biến.
3.3.1.1. Ảnh hưởng của POS đến sự phát triển của vi khuẩn có lợi và có hại
Nghiên cứu ảnh hƣởng của POS đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn có lợi đƣợc thực hiện trên các chủng Lactobacillus và vi khuẩn gây hại trên các chủng E. coli, Samonella typhi, Staphylococcus aureus trong môi trƣờng MR chứa glucose (MRS) hoặc POS 1% (w/v). Kết quả thu đƣợc biểu diễn ở bảng 3.27.
Bảng 3.27 Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và gây hại
Chủng thử nghiệm
Số lƣợng khuẩn lạc tăng sau 24 giờ (Tính theo Lgcfu/ml)
i trư ng MRS i trư ng chứa POS
L1 9,523 ± 0,089 9,768 ± 0,091 L2 9,520 ± 0,090 9,708 ± 0,090 L3 9,488 ± 0,091 9,788 ± 0,089 L4 9,530 ± 0,091 9,714 ± 0,089 L5 9,529 ± 0,089 9,676 ± 0,090 L6 9,514 ± 0,090 9,775 ± 0,091 L7 9,572 ± 0,091 9,695 ± 0,091 L8 9,529 ± 0,090 9,745 ± 0,090 L9 9,595 ± 0,089 9,733 ± 0,091 E. coli 0157:H7 9,563 ± 0,090 8,340 ± 0,076 S. enterica Typhi 9,533 ± 0,091 8,403 ± 0,075 S. aureus ATCC 25923 9,556 ± 0,090 8,628 ± 0,078
Kết quả bảng 3.26 cho thấy cả 9 chủng probiotic Lactobacillus thử nghiệm đều tăng
sinh mạnh trên môi trƣờng chứa POS so với môi trƣờng có glucose, trong đó L. acidophilus (L3) có khả năng tăng sinh mạnh nhất. Khi nuôi cấy E. coli, S. typhi và S.
aureus trong môi trƣờng chứa POS, số lƣợng khuẩn lạc sau 24 giờ đều giảm hơn khi nuôi chúng trong môi trƣờng đối chứng không chứa POS. Với POS từ pectin cam cũng đƣợc nhận thấy làm tăng sinh mạnh L. casei còn L. rhamnosus tăng sinh yếu [76]. Bên cạnh đó, các báo cáo cũng chỉ ra POS có khả năng làm giảm số lƣợng vi khuẩn Clostridia và Bacteroides [25, 76, 92].
Với POS thu đƣợc từ pectin vỏ cam có DP 2 - 4 làm ngăn cản sự bám dính của
E. coli đến tế bào biểu mô đƣờng ruột [96]. POS từ pectin bã táo có khả năng làm tăng số lƣợng vi khuẩn có lợi Lactobacillus, Bifidobacterium, giảm số lƣợng vi khuẩn gây hại
Bacteroides, Clostridium, tạo acid hữu cơ mạch ngắn SCFA [25].
Thực tế hệ vi sinh vật đƣờng ruột luôn bao gồm cả loại có hại, có lợi và chúng có sự tác động qua lại với nhau. Kết quả thử nghiệm về ảnh hƣởng của POS tới sự phát triển của hai loại vi khuẩn có lợi và có hại khi chúng đƣợc nuôi kết hợp trong cùng một môi trƣờng ở bảng 3.28 cho thấy mật độ hỗn hợp vi khuẩn đƣợc cải thiện trong môi trƣờng nuôi khi có mặt của POS, tuy nhiên lƣợng tăng chủ yếu là của L. acidophilus còn vi khuẩn có hại sinh trƣởng chậm (số lƣợng khuẩn lạc L1 và vi khuẩn có hại tăng sau 24 giờ bằng tổng lƣợng L1 + vi khuẩn có hại ở bảng PL7.1, phụ lục 7).
Bảng 3.28 Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển đồng th i của vi khuẩn có lợi và có hại
Chủng thử nghiệm (tỉ lệ 1:1)
Số lƣợng khuẩn lạc tăng sau 24 giờ nuôi (Lgcfu/ml)
L1+ Vi khuẩn có hại L1 Vi khuẩn có hại
L1+ S. enterica Typhi 9,828 ± 0,079 9,818 ± 0,079 8,161 ± 0,050 L1 + E. coli 0157:H7 9,790 ± 0,078 9,782 ± 0,079 8,041 ± 0,053 L1 + S. aureus ATCC 25923 9,792 ± 0,078 9,772 ± 0,078 8,455 ± 0,053 Báo cáo của Chen J. và cộng sự cho thấy Lactobacillus và Bifidobacterium tạo ra 31,64 mM acid acetic, 12,57mM acid lactic, 7,89mM acid propionic và 7,75 mM acid butyric khi nuôi cấy 24 giờ trong môi trƣờng bổ sung POS [25]. Đây có thể là nguyên nhân dẫn đến hiện tƣợng làm giảm pH môi trƣờng, ức chế sự sinh trƣởng của vi khuẩn gây hại. Một giả thuyết nữa cho việc gây giảm số lƣợng vi khuẩn gây hại khi cùng nuôi cấy với
L. acidophilus là do chúng sinh ra bacteriocin làm ức chế sự phát triển của các loại vi khuẩn gây hại.
Để minh chứng hoạt tính sinh học của POS tại cơ quan có thẩm quyền một cách độc lập, chế phẩm POS thô dạng bột (POS 55%) đƣợc gửi đi đánh giá hoạt tính sinh học tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia với các chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy ở phụ lục 8. Kết quả thu đƣợc trình bày trong bảng 3.29 cho thấy chế phẩm POS thô vẫn có khả năng tăng sinh số lƣợng vi khuẩn có lợi nhƣ: Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469, Bifidobacteria bifidum
ATCC 15700 và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922,
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Bảng 3.29Kết quả phân tích hoạt tính sinh học của POS thô dạng bột
Tên mẫu phân tích Chủng thử nghiệm
Số lƣợng khuẩn lạc tăng sau 24 giờ (Tính theo Lgcfu/ml) Môi trƣờng chứa
Glucose
Môi trƣờng chứa POS
Pectic oligosaccharide (POS) Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 7,96 8,26 Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 6,64 6,77 Bifidobacteria bifidum ATCC 15700 8,18 8,25
Escherichia coli ATCC 25922
8,77 8,56
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
7,39 4,79
Nhƣ vậy, qua nghiên cứu ảnh hƣởng của POS đến sự phát triển của vi khuẩn có lợi và gây hại trong điều kiện in vitro có thể thấy POS làm tăng cƣờng sự phát triển của vi sinh vật có lợi thuộc Lactobacillus, Bifidobacteria và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại
E. coli, S. typhi, S. aureus. Kết quả này là cơ sở khoa học để bổ sung POS vào quá trình chế biến tạo sản phẩm chức năng.
3.3.1.2. So sánh khả năng tăng sinh một số chủng vi khuẩn có lợi bởi POS và các prebiotic khác
Để so sánh khả năng sử dụng POS của một số vi khuẩn có lợi với các loại chế phẩm prebiotic khác đang lƣu hành trên thị trƣờng Việt Nam, tiến hành nuôi cấy 9 chủng
Lactobacillus và B. lactis Bb12 với thời gian 24 giờ trong môi trƣờng MR có chứa POS 1% và các loại prebiotic khác 1%: MOStm từ konjac (Trung Quốc), FOS (Orafti P95- Bỉ), Inulin (Merck – Đức). Sau đó, xác định tỷ lệ tăng sinh sau 24 giờ so với môi trƣờng MRS thu đƣợc kết quả biểu diễn ở biểu đồ hình 3.33.
Hình 3.33 Khả năng tăng sinh của các chủng vi khuẩn có lợi thử nghiệm trong m i trư ng chứa các loại prebiotic khác nhau
L1: Lactobacillus rhamnosus GG, L2: L. amylovorus DSM16698, L3: L. acidophilus
NCFM, L4: L. reuteri DSM 17938, L5: L. casei Shirota, L6: L. bulgaricus CH-3, L7: L. fermentum
PCC, L8: L. plantarum 299V, L9: L. johnsonii La1, Bif: B. lactis Bb12
Kết quả cho thấy, tất cả các chủng Lactobacillus và Bifidobacterium thử nghiệm đều sinh trƣởng, phát triển tốt trên môi trƣờng chứa POS và các prebiotic khác. Tuy nhiên, chủng L. rhamnosus, L. acidophilus, L. bulgaricus, L. fermentum và L. plantarum phát triển tốt nhất trên môi trƣờng chứa POS, trong khi đó L. amylovorus sử dụng MOS, L. casei và B. lactis dùng FOS còn L. reuteri và L. johnsonii sử dụng Inulin tốt hơn các loại khác. Nhƣ vậy, POS có thể đƣợc sử dụng làm nguồn cacbon khá tốt cho sự phát triển của vi khuẩn có lợi Lactobacillus và Bifidobacterium.
3.3.1.3. ác định điểm hoạt tính prebiotic của POS
Với mong muốn tạo ra các dòng sản phẩm synbiotics – sản phẩm kết hợp cả vi khuẩn probiotic và prebiotic (ví dụ các dòng sản phẩm sữa chua lợi khuẩn bổ sung chất xơ) có tác dụng tốt tới sức khỏe con ngƣời, ngƣời ta đã tiến hành đánh giá điểm hoạt tính của prebiotic nghiên cứu trên các dòng vi khuẩn probiotic.
Điểm hoạt tính prebiotic (PAS) là một khái niệm đƣợc sử dụng nhằm định lƣợng hiệu quả của prebiotic thuận lợi hơn. Theo Huebner J. và cộng sự điểm prebiotic phản ánh khả năng tăng sinh của hợp chất kiểm tra đối với một chủng vi sinh vật nhất định so với các chủng vi sinh vật khác và so với khả năng tăng sinh của chúng trên một hợp chất không phải là prebiotic nhƣ glucose [53]. Theo đó, điểm prebiotic đƣợc các tác giả này xác định qua mức độ thay đổi của probiotic sau 24 giờ nuôi trong môi trƣờng có chứa 1% prebiotic hoặc 1% glucose so với mức độ thay đổi số lƣợng vi khuẩn đƣờng ruột có hại trong điều kiện nuôi cấy tƣơng tự. Theo phƣơng pháp này điểm hoạt tính của POS trên 9 chủng vi khuẩn probiotic thuộc Lactobacillus đƣợc thể hiện ở đồ thị hình 3.34.
Hình 3.34 Điểm hoạt tính các loại prebiotic đối với các chủng vi khuẩn có lợi
L1: Lactobacillus rhamnosus GG, L2: L. amylovorus DSM16698, L3: L. acidophilus
NCFM, L4: L. reuteri DSM 17938, L5: L. casei Shirota, L6: L. bulgaricus CH-3, L7: L. fermentum
PCC, L8: L. plantarum 299V, L9: L. johnsonii La1, Bif: B. lactis Bb12
Kết quả hình 3.34 cho thấy, chế phẩm POS khi kết hợp với L. acidophilus cho điểm prebiotic cao nhất (0,597) và thấp nhất là L. fermentum (0,525). Điều này có thể do
L. acidophilus sử dụng POS và sinh trƣởng, phát triển nhanh hơn so với L. fermentum. Với MOS, điểm prebiotic cao nhất đạt đƣợc khi kết hợp với L. amylovorus, trong khi ở FOS là
L. bulgaricus và Inulin là B. lactis. Nhƣ vậy, khi tạo chế phẩm sinh học kết hợp giữa vi khuẩn có lợi và POS có thể kết hợp giữa POS với vi khuẩn L. acidophilus để tạo ra chế phẩm có hoạt tính sinh học cao hơn các cách kết hợp khác để ứng dụng trong thực phẩm chức năng hoặc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy hải sản.
Ngoài ra, khi ủ POS 1% (w/v) trong đệm PBS chứa α-amylase (100 U/ml) và pancreatin (0,2% w/v) trong 3 giờ nhận thấy nồng độ và thành phần POS không thay đổi (hình 3.35), điều này cho thấy mẫu POS thử nghiệm này bền trong môi trƣờng đƣờng tiêu hóa của ngƣời và vật nuôi.
Hình 3.35Sắc ký đồ dịch POS khi ủ với enzyme tiêu hóa
Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu cho thấy POS có khả năng làm tăng mật độ tế bào vi khuẩn có lợi và giảm mật độ vi khuẩn có hại khi nuôi cấy riêng rẽ hay hỗn hợp. Kết quả thử nghiệm cũng cho thấy POS khi kết hợp với L. acidophilus (L3) cho điểm hoạt tính prebiotic (PAS) cao nhất so với các chủng thử nghiệm khác. Các kết quả này sẽ là những căn cứ khoa học tốt cho việc ứng dụng POS trong sản xuất thực phẩm chức năng và thức ăn chăn nuôi, góp phần gia tăng giá trị cho nguồn quả chanh leo.
3.3.2. Đán giá c ất lƣợng và vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS
Với mục đích ứng dụng POS chủ yếu trong lĩnh vực thực phẩm phục vụ cho con ngƣời, trong phần này mẫu POS thô dạng bột đƣợc phân tích độc lập tại Viện dinh dƣỡng và Viện kiểm nghiệm thuốc trung ƣơng để đánh giá chất lƣợng và an toàn vệ sinh thực phẩm.
3.3.2.1. Kiểm tra chất lượng sản phẩm
Chế phẩm POS dạng bột đƣợc phân tích các chỉ tiêu chất lƣợng tại Viện dinh dƣỡng. Kết quả thu đƣợc trình bày trong bảng 3.30.
M 1 2 3
G2 G3
G1 M: galacturonic acid, digalacturonic acid,
trigalacturonic acid chuẩn
1: POS sau khi thủy phân
2: POS 1% (w/v) sau khi ủ trong đệm PBS chứa α-amylase (100 U/ml) 3 giờ
3: POS 1% (w/v) sau khi ủ trong pancreatin (0,2% w/v) 3 giờ
Bảng 3.30Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh v t và kim loại trong POS thành phẩm
TT Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả QCVN cho sản phẩm sữa bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi 1 Protein g/100g 1,06 - 2 Đƣờng tổng số g/100g 69,14 - 3 Hàm lƣợng POS g/g 0,5 - 4 Aflatoxin tổng số (B1, G1, B2, G2) µg/kg KPH KQĐ 5 Asen µg/kg KPH 0,5 mg/kg 6 Chì µg/kg 0,12 0,02 mg/kg 7 Thủy ngân µg/kg KPH 0,05 mg/kg 8 Cadimi µg/kg 0,012 1,0 mg/kg
9 Tổng số vi khuẩn hiếu khí CFU /g 7,9 x 102 KQĐ
10 Coliforms CFU /g KPH KPH
11 E. coli CFU /g KPH KPH
12 C. perfringens CFU /g KPH KQĐ
13 Salmonella CFU/25g KPH KPH
14 B. cereus CFU /g 9 x 10 5.102
15 Tổng số bào tử nấm men, mốc Bào tử/g KPH KQĐ
QĐ: h ng qu định, KHP: Không phát hiện
Do Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đến năm 2015 không có quy định cụ thể về các chỉ tiêu vi sinh, hóa lý cho sản phẩm thực phẩm chức năng, tuy nhiên chế phẩm POS thƣờng đƣợc bổ sung vào các sản phẩm bánh, sữa, đồ uống… nên ở đây chọn Quy chuẩn Việt Nam 2011 cho sản phẩm sữa bột trẻ em đến 12 tháng tuổi để làm đối chứng.
Kết quả đánh giá từ Viện Dinh dƣỡng cho thấy chế phẩm POS bột đạt chỉ tiêu vi sinh, hóa lý đối với thực phẩm theo nhƣ Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm QCVN 8-1: 2011/BYT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với
giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm QCVN 8-2: 2011/BYT và Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm QCVN 8-3: 2011/BYT.
Kết quả sắc ký đồ HPAEC trên hình 3.36 cho thấy phổ sản phẩm của chế phẩm POS thô chỉ gồm digalacturonic acid, trigalacturonic acid (24 mg/ml) và lƣợng ít monogalacturonic acid (3 mg/ml). 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 -5 13 25 38 50 63 75 88 1001 [modified by igor] nC min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 -5 13 25 38 50 63 75 88 1002 [modified by igor] nC min
Hình 3.36Sắc ký đồ HPAEC dịch thủy phân pectin chanh leo
A: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn, B: dịch thủy phân pectin chanh leo
Bên cạnh đó, kết quả đánh giá của Viện dinh dƣỡng cho thấy chế phẩm enzyme endopolygalacturonase sản xuất từ A. niger UV06-12-23 không chứa aflatoxin (phụ lục 8) do đó endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23 có thể sử dụng để sản xuất POS ứng dụng trong thực phẩm.
3.3.2.2. Thử nghiệm độc tính cấp của sản phẩm trên chuột
Chế phẩm POS thô đƣợc gửi tới Viện kiểm nghiệm thuốc trung ƣơng để thử độc tính cấp theo hƣớng dẫn của Bộ Y tế ban hành tháng 12/2006.
G1 G2 + G3 G1 G2 + G3 A B G1 G2 + G3 B
Đối tƣợng thí nghiệm là chuột nhắt trắng giống Swiss. Chuột đƣợc chia làm 4 nhóm thử với các mức liều khác nhau trong 7 ngày. Kết quả thu đƣợc biểu diễn ở bảng 3.31.
Bảng 3.31 Bảng theo dõi trọng lượng chuột khi cho ăn POS
STT N m đối c ứng STT Nhóm 1 Trƣớc TN (g) Sau TN (g) Trƣớc TN (g) Sau TN (g) 1 18,16 25,66 11 19,54 25,64 2 18,45 24,35 12 19,78 26,84 3 18,64 24,15 13 18,69 26,14 4 19,75 25,61 14 18,34 26,34 5 19,21 25,34 15 19,48 26,15 6 19,36 26,01 16 19,75 26,14 7 19,56 26,34 17 20,14 25,36 8 20,14 27,85 18 20,43 25,39 9 20,12 26,54 19 19,78 25,64 10 19,66 25,34 20 19,37 26,13 STT Nhóm 2 STT Nhóm 3 Trƣớc TN (g) Sau TN (g) Trƣớc TN (g) Sau TN (g) 21 18,64 25,35 31 19,32 26,12 22 18,34 25,78 32 19,34 26,24 23 19,34 25,94 33 19,64 26,35 24 19,37 25,34 34 19,45 26,37 25 19,35 26,12 35 19,85 25,35 26 19,75 26,17 36 19,43 25,36 27 19,76 26,47 37 18,99 24,98 28 20,14 26,75 38 20,17 26,34 29 20,19 27,11 39 20,13 25,34 30 20,17 26,58 40 20,47 26,69
Kết quả cho thấy chuột ở nhóm đối chứng và các nhóm uống POS tăng trọng lƣợng cơ thể gần nhƣ đều nhau trong thời gian theo dõi.
Về tiêu thụ thức ăn và nƣớc uống, ở nhóm đối chứng và nhóm chuột uống POS hoạt động và ăn uống bình thƣờng, không nhận thấy có biểu hiện gì khác thƣờng.
Về dấu hiệu ngộ độc: Không nhận thấy có biểu hiện ngộ độc ở các nhóm uống POS trong thời gian theo dõi. Không có chuột chết trong quá trình thử nghiệm.
Nhƣ vậy, chế phẩm POS dạng bột khi cho chuột uống với mức liều từ 20,0 g – 60,0 g mẫu thử/ kg chuột không nhận thấy biểu hiện khác thƣờng so với nhóm đối chứng, không nhận thấy có biểu hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Tất cả chuột đều ăn uống, hoạt động bình thƣờng. Không xác định đƣợc liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) vì mẫu thử không gây chết chuột thử nghiệm ở mức liều tối đa nhất có thể cho uống.
Từ kết quả phân tích các chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm trên, chế phẩm POS thô