3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.3. Thu hồi và tinh sạch POS từ dịch thủy phân
Trong sản phẩm dịch thủy phân ngoài POS (digalacturonic acid và trigalacturonic acid) vẫn còn chứa một phần nhỏ các sản phẩm phụ nhƣ pectin thủy phân chƣa sâu (pectin khối lƣợng phân tử thấp), monogalacturonic acid và enzyme. Do vậy, trong phần này các công đoạn của quá trình tinh sạch đƣợc nghiên cứu nhằm tạo ra nhiều dòng sản phẩm để đa dạng hóa các mục đích sử dụng (ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, y dƣợc và phân tích).
3.2.3.1. Tinh sạch POS bằng kỹ thu t lọc màng
Monogalacturonic acid có khối lƣợng nhỏ nên chỉ có thể loại bỏ bằng phƣơng pháp lọc nano hoặc lọc gel trao đổi ion. Để loại bỏ pectin khối lƣợng phân tử thấp có thể sử dụng phƣơng pháp lọc màng với kích thƣớc màng phù hợp.
Do kích thƣớc POS (digalacturonic acid, trigalacturonic acid) < 1 kDa nên lọc bằng màng 1 kDa có thể thu hồi đƣợc POS ở dịch thấm qua màng. Tuy nhiên nếu sử dụng ngay dịch sau khi thủy phân lọc qua màng 1 kDa thì màng sẽ bị tắc, các phân tử lớn sẽ bít hết các lỗ trên màng, quá trình lọc không thể diễn ra, do đó cần có bƣớc lọc sơ bộ qua màng kích thƣớc lớn hơn (> 1 kDa) để loại bớt các phân tử kích thƣớc lớn nhƣ protein enzyme, pectin, pectin khối lƣợng phân tử thấp.
Lọc dòng ngang (cut-off) là một phƣơng pháp tinh sạch khá hiệu quả và thƣờng đƣợc sử dụng do vừa tinh sạch vừa cô đặc sản phẩm. Do vậy ở phần này, quá trình lọc dòng ngang 2 bƣớc: qua màng 10 và 1 kDa đƣợc nghiên cứu.
Từ 10 lít dịch POS sau khi thủy phân đƣợc ly tâm và lọc lần lƣợt qua màng 10 kDa và màng 1 kDa. Dịch lọc qua màng đƣợc xác định hàm lƣợng POS và pectin khối lƣợng
phân tử thấp trên màng đƣợc xác định bằng kit D-galacturonic. Tiếp theo đó hiệu suất thu hồi và thành phần POS đƣợc xác định để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp tinh sạch. Kết quả đƣợc biểu diễn trên bảng 3.10 và hình 3.29B.
Bảng 3.20 Hiệu suất thu hồi POS sau lọc dòng ngang
Thể tích (lít) Tổng lƣợng Pectin khối lƣợng phân tử thấp (g) Tổng lƣợng POS (g) Hiệu suất thu hồi (%) Dịch đầu 10 27,1 ± 0,5 242,7 ± 5,7 100 Dịch qua màng 10 kDa 9,5 3,5 ± 0,1 214,2 ± 4,5 88,2 ± 1,80 Dịch qua màng 1 kDa 9,0 0 200,4 ± 4,1 82,5 ± 1,75
Kết quả cho thấy sau khi lọc qua màng 10 kDa lƣợng pectin khối lƣợng phân tử thấp giảm đi đáng kể so với dịch ban đầu (3,5 g và 27,1 g), trong khi hiệu suất thu hồi POS 88,2 %. Tiếp tục lọc bằng màng 1 kDa, dịch qua màng không chứa pectin khối lƣợng phân tử thấp với hiệu suất thu hồi POS đạt 82,5%. Sắc ký đồ hình 3.28B (giếng 3) cũng cho thấy dịch POS sau khi lọc chỉ gồm monogalacturonic acid, digalacturonic acid và trigalacturonic acid.
3.2.3.2. Tinh sạch POS qua cột sắc ký
Để đánh giá hoạt tính sinh học và các đặc tính khác của POS cũng nhƣ nhằm ứng dụng POS trong y dƣợc, cần phải tinh sạch POS nghĩa là loại bỏ các sản phẩm phụ (monogalacturonic acid, pectin khối lƣợng phân tử thấp...) ra khỏi hỗn hợp oligosaccharide. Nhƣ trên đã trình bày, pectin khối lƣợng phân tử thấp đƣợc loại khỏi dung dịch nhờ phƣơng pháp lọc 2 bƣớc lần lƣợt qua màng 10 kDa và 1 kDa, với monogalacturonic acid một số tác giả báo cáo có thể sử dụng phƣơng pháp sắc ký lọc gel và lọc nano để tách riêng monogalacturonic acid ra khỏi hỗn hợp oligosaccharide, do đó trong phần này sử dụng phƣơng pháp sắc ký lọc gel với gel Toyopearl GigaCap Q-650M để đánh giá hiệu quả quá trình lọc.
Dịch POS sau khi lọc qua màng 1 kDa đƣợc tinh sạch tiếp bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel. Gel Toyopearl GigaCap Q-650M đƣợc nhồi vào cột và chạy 1 ml dung dịch POS lên cột, rửa chiết và thu các phân đoạn 1,5 ml vào từng ống riêng. Xác định hàm lƣợng từng thành phần, hiệu suất thu hồi và biểu diễn kết quả trên bảng 3.20 và hình 3.29.
Hình 3.29 Các ph n đoạn POS khi lọc gel (A) và TLC sản phẩm khi tinh sạch (B)
1: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; 2: dịch POS sau khi lọc qua màng 10 kDa ; 3: dịch POS sau khi lọc qua màng 1 kDa; 4: dịch chiết ở phân đoạn 15, 5:
dịch chiết ở phân đoạn 40
Kết quả hình 3.29A cho thấy dịch POS sau khi lọc thu đƣợc 2 đỉnh tƣơng ứng với phân đoạn 13 – 24 và phân đoạn 34 – 41. Phân tích thành phần của 2 đỉnh này trên bản sắc ký hình 3.29B cho thấy ở phân đoạn 15 (đỉnh 1) chỉ chứa digalacturonic acid và trigalacturonic acid (giếng 4), còn ở phân đoạn 40 (đỉnh 2) chỉ chứa monogalacturonic acid (giếng 5). Với phân đoạn POS từ 13 – 24, tổng hàm lƣợng POS thu đƣợc là 379,7 mg nhƣ vậy hiệu suất thu hồi POS sau khi lọc gel là 78,6% (bảng 3.21).
Bảng 3.21 Hiệu suất thu hồi POS sau khi lọc gel
Tổng lƣợng POS (mg)
Tổng lƣợng mono galacturonic acid (mg)
Hiệu suất thu hồi (%)
Dịch qua màng 1 kDa 398,4 ± 1,7 30,2 ± 0,5 82,5 ± 1,75
Dịch sau lọc gel 379,7 ± 1,5 0 78,6 ± 1,78
Mặc dù sử dụng gel Toyopearl GigaCap Q-650M đã tách đƣợc monogalacturonic acid ra khỏi hỗn hợp digalacturonic acid và trigalacturonic acid nhƣng với phƣơng pháp này vẫn chƣa tách riêng rẽ đƣợc digalacturonic acid và trigalacturonic acid ra khỏi nhau, có thể do cột chƣa đủ dài để tách hoặc điều kiện, đệm chạy chƣa tối ƣu. Để định lƣợng đƣợc từng thành phần oligosaccharide có trong hỗn hợp POS cần phải có các nghiên cứu thêm về loại gel, loại cột hay chế độ lọc,...
A B G2 G1 G3 G1 G2 + G3
Nhƣ vậy, dịch POS sau khi lọc gel không chứa monogalacturonic acid và chỉ bao gồm digalacturonic acid và trigalacturonic acid.
3.2.4. Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm POS
Dịch thủy phân pectin từ vỏ chanh leo chứa POS và một ít sản phẩm phụ (pectin, monogalacturonic acid...). Trong đó pectin là chất xơ thực phẩm và an toàn với con ngƣời. Do vậy, toàn bộ dịch thủy phân có thể sử dụng làm sản phẩm POS thô ứng dụng bổ sung vào các lĩnh vực sản xuất thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và đồ uống.
3.2.4.1. Tạo chế phẩm POS dạng bột
a. Ản ưởng của nồng độ ch t khô trong dịch POS
Trong công nghệ sấy phun, nồng độ chất khô của dịch trƣớc khi sấy có vai trò rất quan trọng, ảnh hƣởng trực tiếp đến chất lƣợng sản phẩm, hiệu suất thu hồi và sản lƣợng sấy phun. Nồng độ dịch quá cao sẽ làm cho sản phẩm bị cháy, vón cục,... làm giảm chất lƣợng sản phẩm, hiệu suất thu hồi thấp, thao tác sấy khó khăn. Nồng độ chất khô thấp sẽ hao tổn nhiều năng lƣợng sấy và sản lƣợng thấp.
Đối với các sản phẩm khác nhau, phụ thuộc vào độ nhớt, thành phần cấu tạo và các tính chất hóa lý khác, thông số về nồng độ chất khô thích hợp cho quá trình sấy không giống nhau. Do vậy, đối với nghiên cứu này, dịch POS trƣớc khi vào sấy phun thƣờng có nồng độ chất khô thấp nên phải bổ sung chất mang (maltodextrin) tới hàm lƣợng chất khô 10 - 16% và sấy với nhiệt độ đầu vào 170oC, tốc độ tiếp liệu 2,5 lít/giờ. Kết quả đƣợc biểu diễn ở bảng 3.22 cho thấy, ở hàm lƣợng chất khô 12 – 16% bột POS sau khi sấy tơi, không bết dính, khô, thao tác dễ, sản lƣợng phù hợp. Tuy nhiên, ở nồng độ chất khô 12% sản phẩm POS chứa ít maltodextrin hơn và hiệu suất thu hồi cao hơn (92%), do đó lựa chọn nồng độ chất khô 12% cho nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.22 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô dịch POS trước khi sấy phun Hàm lƣợng chất khô dịch thủy phân (%) Hàm lƣợng maltodextrin bổ sung (%) Hàm lƣợng chất khô (%) Hiệu suất thu hồi (%) Sản lƣợng (g/h) Cảm quan, đánh giá 7 3 10 86 130 Bột bết dính thành thiết bị,
hơi ẩm, không cháy, thao tác khó, sản lƣợng thấp 7 5 12 92 165 Bột tơi k ông ết dính, khô, thao tác dễ, sản lƣợng phù hợp 7 7 14 88 175 Bột tơi không bết dính, khô, thao tác dễ, sản lƣợng phù hợp 7 9 16 84 200 Bột tơi không bết dính, khô, thao tác dễ, sản lƣợng phù hợp
b. Ản ưởng của chế độ s y phun
Các yếu tố ảnh hƣởng trong quá trình sấy phun lại có sự ảnh hƣởng qua lại lẫn nhau rất khăng khít, ví dụ nếu vật liệu vào sấy có độ nhớt cao thì phải pha loãng, giảm nồng độ chất khô đồng thời vận tốc tiếp liệu phải giảm, nhiệt độ sấy phải tăng cao để tăng cƣờng sự bốc hơi nƣớc. Vì thế việc nghiên cứu xác định thông số công nghệ cho quá trình sấy thƣờng đƣợc nghiên cứu tính toán sơ bộ tạo ra các tổ hợp thông số thích hợp, sau đó thử nghiệm so sánh hiệu quả giữa các tổ hợp này với nhau để chọn ra công nghệ tối thích cho cả quá trình.
Với sản phẩm POS, tiến hành thử nghiệm sấy phun ở các tổ hợp thông số công nghệ nhƣ sau: dùng maltodextrin chỉnh nồng độ chất khô về Bx = 12, sau đó ba mẫu đƣợc phân tách và sấy ở 3 tổ hợp nhƣ bảng 3.23.
Bảng 3.23 Ảnh hưởng của chế độ sấ đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm
TT Chế độ sấy Hiệu suất
thu hồi (%)
Sản lƣợng (g/h)
Cảm quan, đánh giá
1 Nhiệt độ đầu vào 200oC 84 420 Bột bết, cháy,
dính nhiều trên thiết bị, thao tác
khó Tốc độ tiếp liệu 3 lít/giờ
Tốc độ đầu bơm ly tâm
23000 vòng/phút
2 Nhiệt độ đầu vào 170oC 93 427 Bột tơi k ô vừa tới, không dính bết, thao tác dễ
Tốc độ tiếp liệu 2,5 lít/giờ
Tốc độ đầu bơm ly tâm
23000 vòng/phút
3 Nhiệt độ đầu vào 150oC 93 425 Bột không cháy
nhƣng bết, còn dính nhiều trên thiết bị, thao tác
khó Tốc độ tiếp liệu 2,0 lít/giờ
Tốc độ đầu bơm ly tâm
23000 vòng/phút
Kết quả bảng trên cho thấy điều kiện sấy thích hợp nhất đối với sản phẩm POS là: nhiệt độ đầu vào 170oC, tốc độ tiếp liệu 2,5 lít/giờ, tốc độ đầu bơm ly tâm 23000 vòng/phút.
Từ 60 lít dịch POS, sau khi phối trộn với maltodextrin tới Bx = 12 và sấy phun với điều kiện nhƣ trên thu đƣợc 2,56 kg chế phẩm POS 55%.
Hình 3.30 Các dạng chế phẩm POS
A: chế phẩm POS thô dạng lỏng, B: chế phẩm POS thô dạng bột, C: chế phẩm POS tinh sạch, D: chế phẩm POS bột bảo quản trong túi thiếc, E: chế phẩm POS bảo quản trong túi PE
3.2.4.2. Nghiên cứu bảo quản chế phẩm POS
a. Tạo sản phẩm POS dạng lỏng
Với mong muốn bảo quản pectic oligosaccharide đƣợc lâu và phù hợp với đa dạng mục đích sử dụng, tiến hành nghiên cứu nồng độ chất bảo quản và thời gian thích hợp.
Natri benzoat là hợp chất hóa học hữu cơ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật và nằm trong danh mục các chất bảo quản thực phẩm đƣợc lƣu hành tại Việt Nam. Chất này đƣợc sử dụng phổ biến và không làm ảnh hƣởng tới hƣơng vị, thành phần của sản phẩm do đó nghiên cứu Natri benzoat bổ sung vào dung dịch POS.
Chế phẩm POS thô
Dung dịch POS thô sau khi thủy phân đƣợc bảo quản bằng Natri benzoat với nồng độ 0,005%; 0,01% và 0,05% (w/v). Sản phẩm đƣợc bảo quản ở nhiệt độ thƣờng (25o
C) và mát (4oC) trong 7 ngày. Kết quả đánh giá thông qua số lƣợng vi sinh vật hiếu khí tổng số phát triển trên môi trƣờng thạch. Kết quả đƣợc biểu diễn trên bảng 3.24 cho thấy sau 7 ngày bảo quản ở nhiệt độ thƣờng, POS bổ sung Natri benzoat 0,01% (w/v) không thấy có sự phát triển của vi sinh vật còn nếu bảo quản ở điều kiện mát thì chỉ cần bổ sung natri
A B C
benzoat 0,005% (w/v). Hàm lƣợng POS trong sản phẩm giảm khi không bổ sung natri benzoat do vi khuẩn phát triển, sử dụng POS làm nguồn thức ăn. Khi bổ sung natri benzoat 0,01% hàm lƣợng POS ổn định do đó lựa chọn nồng độ natri benzoat 0,01% (w/v) cho nghiên cứu bảo quản chế phẩm POS tinh sạch dạng lỏng tiếp theo.
Bảng 3.24Kết quả đánh giá mức độ nhiễm của vi sinh v t sau 7 ngày bảo quản
Thời gian (ngày) Nồng độ Natri benzoat (%) Số lƣợng vi sinh vật hiếu khí tổng số (CFU/ml) Hàm lƣợng POS (mg/ml) 25oC 4oC 25oC 4oC 0 0 0 0 24,50 24,50 7 0 Nhiều Nhiều 18,82 20,15 0,005 300 0 20,43 24,18 0,01 0 0 24,45 24,46 0,05 0 0 24,48 24,50
Nguyễn T.V.A và cộng sự khi bảo quản arabinoxylan từ cám gạo làm thực phẩm chức năng cũng sử dụng natri benzoat với nồng độ 0,01% (w/v) [5].
Phƣơng pháp bảo quản này có thể sử dụng để bảo quản dịch POS sau khi thủy phân nếu chƣa đƣợc tinh sạch hoặc sử dụng kịp thời.
Chế phẩm POS tinh sạch
Tiến hành nghiên cứu bổ sung Natri benzoat 0,01% (w/v) vào dung dịch POS sau khi tinh sạch (dạng lỏng) và bảo quản trong 12 tháng. Kết quả đánh giá thông qua số lƣợng vi sinh vật phát triển trên môi trƣờng thạch và hàm lƣợng POS. Kết quả đƣợc biểu diễn trên bảng 3.25 cho thấy chế phẩm POS tinh sạch dạng lỏng đƣợc bảo quản dƣới nhiệt độ thƣờng sau 12 tháng số lƣợng vi sinh vật tổng số hiếu khí khá nhiều, không thấy sự phát triển của một số vi khuẩn gây bệnh nhƣ E. coli, Samonella và bào tử nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, hàm lƣợng POS giảm nhẹ chính vì vậy đối với chế phẩm POS tinh sạch dạng lỏng chỉ nên bảo quản thời gian < 12 tháng cho mục tiêu sử dụng POS làm thực phẩm chức năng.
b. Điều kiện bảo quản POS thô dạng bột
Để đánh giá hiệu quả bảo quản chế phẩm sau 1 – 12 tháng, tiến hành kiểm tra hàm lƣợng POS, chỉ tiêu vi sinh vật, hàm ẩm, trạng thái của chế phẩm POS thô dạng bột đƣợc
bảo quản trong túi thiếc. Kết quả thu đƣợc biểu diễn trên bảng 3.26 cho thấy chế phẩm POS thô đƣợc bảo quản dƣới dạng bột trong túi thiếc sau 12 tháng chất lƣợng gần nhƣ không thay đổi so với ban đầu. Chính vì vậy, sử dụng phƣơng pháp này để bảo quản chế phẩm POS dƣới dạng nguyên liệu để sản xuất sản phẩm bánh bích quy bổ sung POS.
Bảng 3.25Kết quả đánh giá chất lượng POS lỏng sau 6 tháng bảo quản
Thời gian bảo quản (tháng) 0 1 2 4 6 8 12 Hàm lƣợng POS (mg/ml) 24,50 24,50 24,47 24,45 24,40 24,40 23,30 Vi sinh vật tổng số hiếu khí (CFU/ml) 0 0 30 60 90 100 350 E. coli (CFU/ml) 0 0 0 0 0 0 0 Samonella (CFU/ml) 0 0 0 0 0 0 0 Tổng số bào tử nấm men, mốc (bào tử/ml) 0 0 0 0 0 0 0
Bảng 3.26 Chất lượng của POS dạng bột sau 12 tháng bảo quản
Thời gian bảo quản (tháng) 0 1 2 4 6 8 12
Hàm lƣợng POS (%) 55 55 55 55 55 54 54 Vi sinh vật tổng số hiếu khí (CFU/g) 0 0 0 0 0 0 0 E. coli (CFU/g) 0 0 0 0 0 0 0 Samonella (CFU/g) 0 0 0 0 0 0 0 Tổng số bào tử nấm men, mốc (bào tử/g) 0 0 0 0 0 0 0 Hàm ẩm (%) 6,00 6,04 6,06 6,07 6,07 6,08 6,14 Trạng thái Bột mịn Màu sắc Vàng nâu nhạt
Với các điều kiện thủy phân pectin vỏ chanh leo tạo POS, điều kiện sấy và bảo quản luận án đã xây dựng quy trình sản xuất các loại chế phẩm POS thô từ pectin vỏ chanh leo nhƣ hình 3.31.
Hình 3.31 Sơ đồ quy trình thu nh n các loại chế phẩm POS từ pectin vỏ chanh leo
Sấy phun
Phối trộn maltodextrin tới 12oBx, nhiệt độ đầu vào 170oC,
ra 80oC, tốc độ tiếp liệu 2,5 lít/giờ
Dịch thủy phân
Cô đặc
Cô chân không, 50oC Lọc cut-off Màng 10 kDa và 1 kDa Pectin chanh leo Enzyme EPG Thủy phân
Pectin 3%, enzyme 44 U/g, pH 4, 53oC, 270 v/p, 4 giờ
Sắc ký lọc gel
Gel Toyopear GigaCap Q650M Chế phẩm POS thô dạng lỏng Chế phẩm POS thô dạng bột Chế phẩm POS tinh sạch Bảo quản Natri benzoat 0,01%
Thuyết minh quy trình:
Chế phẩm POS thô dạng lỏng:
Chuẩn bị nguyên liệu: Pectin từ vỏ chanh leo đƣợc hòa tan trong đệm citrate phosphate pH 4 với nồng độ pectin 3% (w/v) bằng cách khuấy trong thùng inox 100 lít, có cánh khuấy và gia nhiệt đến 40oC trong 2 giờ.
Thủy phân: Dịch pectin hòa tan đƣợc gia nhiệt lên 53oC sau đó bổ sung enzyme endopolygalacturonase với nồng độ 44 U/g pectin. Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện trong 4 giờ với tốc độ khuấy 270 vòng/phút, duy trì nhiệt độ 53oC. Kết thúc quá trình thủy