3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Sản xuất pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo
3.2.1. Thu nhận và chuyển hóa HM pectin thành LM pectin
a. Thu nhận pectin từ vỏ chanh leo
Hiện nay, nhiều cơ sở sản xuất, chế biến chanh leo cung cấp cho thị trƣờng trong và ngoài nƣớc những sản phẩm nhƣ nƣớc chanh leo cô đặc hoặc nƣớc lạc tiên... Nguồn vỏ quả thải ra từ quá trình chế biến này là rất lớn và khá tập trung đảm bảo cho việc tận thu pectin từ nguồn phụ phẩm này. Bên cạnh đó, hàm lƣợng pectin thu đƣợc từ vỏ chanh leo cao. Vì vậy, lựa chọn pectin chanh leo làm nguồn cơ chất cho quá trình nghiên cứu các điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS.
Qua khảo sát các tác nhân vật lý (nhiệt độ cao, nƣớc nóng), hóa học (acid citric) và enzyme (cellulase) nhận thấy pectin thu nhận bằng vật lý và enzyme có DE cao (thuộc dạng pectin có mức độ methyl hóa cao), có khả năng tạo gel tốt, thích hợp cho các ứng dụng bổ sung vào thực phẩm làm chất làm dày sản phẩm. Pectin thu nhận bằng acid citric có DE thấp hơn, phù hợp với mục đích của nghiên cứu thu nhận pectin cho sản xuất POS.
Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng các yếu tố đến quá trình tách chiết pectin từ vỏ quả chanh leo tím bằng acid citric đƣợc thực hiện ở các khoảng pH 2 – 6 với nhiệt độ 20 - 120oC trong 5 - 15 phút. Sau đó thu dịch pectin và kết tủa bằng ethanol lạnh với tỷ lệ ethanol: dịch pectin là 1: 1, 2: 1, 3:1 và sấy ở 50oC để thu pectin dạng sợi.
Hình 3.17 Ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hiệu suất thu pectin chanh leo
pH (A), nhiệt độ (B), thời gian (C) và tỷ lệ ethanol: dịch lọc (D)
A B
Kết quả thí nghiệm trên hình 3.17 cho thấy pectin từ vỏ chanh leo tím đƣợc thu nhận với hiệu suất cao nhất ở pH 2,0 tại nhiệt độ 100oC trong 10 phút và kết tủa pectin bằng ethanol lạnh (0oC) với tỷ lệ 3:1.
Xây dựng quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo
Tiến hành thu nhận pectin từ vỏ chanh leo trên quy mô 100 kg, thu đƣợc 2,6 kg pectin nên hiệu suất thu pectin trên quy mô lớn vẫn đảm bảo (2,6 – 2,8%). Do vậy quy trình tách chiết pectin từ vỏ chanh leo đƣợc đề xuất theo hình 3.18.
Hình 3.18 Sơ đồ quy trình thu nh n pectin từ vỏ chanh leo
Xử lí nguyên liệu
(cắt, chần acid citric 3%, nghiền)
Chiết pectin
(pH 2, 100oC, 10 phút)
Thu dịc Cô đặc
(50oC, cô chân không tới 25oBx)
Kết tủa (ethanol lạnh 0oC, tỷ lệ 3:1) Sấy (nhiệt độ 50oC) Vỏ chanh leo PECTIN Đ ng g i ảo quản
Quy trình cụ thể nhƣ sau:
Bƣớc 1: Xử lý nguyên liệu
Vỏ chanh leo đƣợc rửa sạch dƣới nƣớc máy rồi chần vỏ trong dung dịch acid citric 3% ở 100oC trong 5 phút nhằm loại bỏ một số chất dễ oxi hóa, đƣờng, các chất màu trong vỏ chanh và bất hoạt các enzyme oxi hóa.
Vỏ chanh sau khi chần đƣợc nghiền mịn và bổ sung nƣớc cất theo tỉ lệ 1 kg nguyên liệu: 3 kg nƣớc sau đó đƣợc chuyển qua giai đoạn chiết rút pectin.
Bƣớc 2: Chiết pectin bằng acid citric
Pectin đƣợc hòa tan tốt trong môi trƣờng acid, vì vậy tiến hành bổ sung acid citric cho đến khi đạt pH 2,0, gia nhiệt đến 100C trong 10 phút.
Bƣớc 3: Thu nhận dịch và cô đặc
Hỗn hợp dịch sau chiết bằng acid citric đƣợc lọc bõ bã, thu dịch pectin thô (2,5oBx) rồi tiến hành cô đặc 10 lần (25oBx) bằng phƣơng pháp cô quay chân không ở 50C.
Bƣớc 4: Tinh sạch pectin bằng phƣơng pháp kết tủa
Dịch pectin thô sau khi đƣợc cô đặc sẽ tiến hành kết tủa bằng ethanol lạnh với tỷ lệ 3:1 trong 2 giờ để thu pectin tinh khiết hơn. Kết tủa đƣợc thu bằng máy ép.
Bƣớc 5: Sấy thu pectin dạng sợi. Đóng gói và bảo quản pectin.
Chất lƣợng của pectin từ vỏ chanh leo
Xác định thành phần hóa học cùng chất lƣợng của pectin đƣợc biểu diễn trong bảng 3.12 cho thấy hàm lƣợng pectin thu đƣợc theo phƣơng pháp tách chiết bằng acid citric rất cao, đạt tới 95%, mức độ este hóa (DE) của pectin tách chiết từ vỏ chanh leo tím là 70% (HMP) và của pectin tách chiết từ chanh leo vàng là 38% (LMP). Pectin tách đƣợc không chứa protein và hàm lƣợng tinh bột không đáng kể, hiệu suất thu nhận cao nhƣ một số tác giả khác [61, 62, 102].
Sản phẩm pectin đảm bảo tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm cho quá trình nghiên cứu sản xuất pectic oligosaccharide (bảng 3.15).
Bảng 3.15 Thành phần của pectin tách chiết từ vỏ chanh leo Thành phần hóa học àm lƣợng Pectin (%) 95 DE pectin (%) 70 (Chanh tím) - HMP 38 (Chanh vàng) - LMP Độ ẩm (%) 5,47 Hàm lƣợng tinh bột (%) 0,5 Hàm lƣợng protein (%) 0
Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) 6×10
Coliform (MPN/g) 10
S. aureus (CFU/g) 0
Hiệu suất thu nhận pectin (%) 2,8
b. Chuyển hóa HM pectin thành LM pectin
Pectin từ vỏ chanh leo tím thuộc dạng HM Pectin (pectin có mức độ methyl hóa cao). Trong khi endopolygalacturonase hoạt động phân cắt hiệu quả hơn trên LM pectin để tạo POS. Cùng với đó nguồn vỏ chanh leo từ các cơ sở sản xuất ở Việt Nam chủ yếu là chanh leo tím. Do vậy, để ứng dụng pectin từ chanh leo tím vào sản xuất pectic oligosaccharide trƣớc hết cần nghiên cứu chuyển hóa HM pectin thành LM pectin.
Việc chuyển hóa HM pectin thành LM pectin thƣờng đƣợc thực hiện bằng cách: loại bỏ nhóm methoxyl trên phân tử pectin bằng acid hoặc bazơ mạnh [117]. Trong nghiên cứu này HM pectin từ chanh leo 2% (w/v) đƣợc chuyển hóa thành LM pectin bằng HCl 1 % (v/v) ở điều kiện tốc độ khuấy 50 v/p, nhiệt độ 70oC trong 1 - 6 giờ. Kết quả bảng 3.16 cho thấy cần thời gian 4 - 6 giờ để chuyển hóa pectin từ vỏ chanh leo tím thành dạng LM pectin (DE 34 – 47) với hiệu suất đạt 86 - 89%. Chỉ số DE thu đƣợc của LM pectin tƣơng đƣơng chỉ số của LM pectin thƣơng mại, ví dụ Genupectin L12CG (Hercules, Copenhagen, Denmark có DE = 35%). HM pectin sau khi thu có màu nâu đỏ, dạng sợi sau khi chuyển hóa thành LM pectin có dạng bột, màu nhạt hơn và hòa tan tốt hơn (hình 3.19).
Bảng 3.16 Ảnh hưởng của th i gian đến chuyển hóa HM pectin thành LM pectin
Thời gian (giờ) Hiệu suất thu hồi Pectin (%) DE (%)
0 95,10 ± 1,12 70,00 1 94,59 ± 1,00 64,21 2 92,35 ± 1,23 59,00 3 90,92 ± 1,05 52,16 4 89,19 ± 1,12 47,23 5 88,15 ± 1,11 40,06 6 86,83 ± 1,04 34,02
Hình 3.19 Pectin vỏ chanh leo tím trước và sau khi chuyển hóa
Trƣớc chuyển hóa (A), sau khi chuyển hóa (B)
3.2.2. Xác định điều kiện thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo pectic oligosaccharide
Các công trình khoa học đã cho thấy chỉ có các sản phẩm thủy phân pectin ở kích thƣớc nhỏ (DP 2 và DP 3) mới cho nhiều hoạt tính sinh học quý nhƣ tăng cƣờng sự phát triển của vi sinh vật có lợi, ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại đƣờng ruột, ức chế sự bám dính của E. coli vào tế bào biểu mô ruột, chống ung thƣ, chống oxi hóa,... [68, 70, 110, 111]. Do vậy, các nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân pectin tạo POS đƣợc thực hiện sao cho hiệu suất chuyển hóa cao đồng thời phải đảm bảo sản phẩm của quá trình thủy phân chứa chủ yếu digalacturonic và trigalacturonic acid.
Để chủ động nguồn enzyme, trong nghiên cứu này endopolygalacturonase thƣơng mại (Pectinex Ultra SP-L) đƣợc sử dụng để nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo và sau đó ứng dụng quy trình này trên enzyme nghiên cứu (endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23) để sản xuất POS.
3.2.2.1. Lựa chọn nồng độ pectin
Tiến hành thủy phân pectin từ chanh leo với các nồng độ 1, 2, 3, 4 và 5% (w/v) trong thời gian 4 giờ. Tiến hành lấy mẫu sau mỗi 1 giờ để xác định hàm lƣợng POS. Kết quả thu đƣợc biểu diễn ở hình 3.19 cho thấy trong khoảng khảo sát, với cùng một lƣợng enzyme sử dụng (20 U/g) nhận thấy ở các nồng độ cơ chất thấp (1 và 2%) phản ứng diễn ra nhanh chóng, sản phẩm đạt cực đại chỉ sau 2 - 3 giờ. Khi tăng nồng độ cơ chất lên độ nhớt của dịch phản ứng tăng nhanh và vận tốc phản ứng cũng giảm xuống rõ rệt nhất là ở nồng độ 4 - 5%. Với nồng độ pectin 3% (w/v) tốc độ phản ứng đƣợc duy trì và ổn định trong khoảng 3 giờ, hàm lƣợng oligosaccharide ngày càng tăng lên (hình 3.20A). Phổ sản phẩm trên hình 3.20B cho thấy ở nồng độ 4 - 5% còn nhiều pectin chƣa đƣợc thủy phân.
Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; B: giếng 1-5 tƣơng ứng với nồng độ cơ chất 1, 2, 3, 4, 5%
Nồng độ pectin 3% (w/v) cũng đƣợc sử dụng trong quy trình sản xuất POS của Sáng chế Canada số CA 2428473. Pectin cam nồng độ 3% (30 g/l) đƣợc thủy phân bằng endopolygalacturonase của Pectinex PL (Amano), sản phẩm POS thu đƣợc chứa DP 2 – 10 chiếm 80,4% [22]. Nồng độ cơ chất 3% (w/v) đƣợc lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp với các lƣợng enzyme khác nhau nhằm tăng lƣợng POS tạo thành.
M 1 2 3 4 5 G2 G3 G1 B A
3.2.2.2. Tỷ lệ en me/cơ chất thích hợp
Tỷ lệ enzyme/cơ chất là một yếu tố vô cùng quan trọng, ảnh hƣởng lớn tới quá trình thủy phân. Cần lƣu ý rằng, với yêu cầu thủy phân giới hạn để tạo ra các oligosaccharide mong muốn, nên tỷ lệ enzyme/cơ chất đƣợc sử dụng để thủy phân phải đảm bảo yêu cầu quá trình hoạt động tốt nhƣng không thủy phân hoàn toàn pectin để tạo thành mono galacturonic acid.
Tiến hành thủy phân pectin vỏ chanh leo với nồng độ pectin 3% (w/v) trong đệm citrat pH 4,0. Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện trong 4 giờ có bổ sung endopolygalacturonase ở các tỷ lệ enzyme/cơ chất là 20 - 60 U/g pectin. Xác định hàm lƣợng POS tạo thành sau mỗi giờ và thành phần POS bằng sắc kí lớp mỏng (TLC). Kết quả đƣợc biểu diễn ở hình 3.21.
Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ en me/cơ chất đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; giếng 1-5 tƣơng ứng với tỷ lệ enzyme/cơ chất 20, 30, 40, 50, 60 U/g.
Thử nghiệm thủy phân ở nồng độ cơ chất 3% (w/v) cho thấy khi sử dụng tỷ lệ enzyme/cơ chất 20 và 30 U/g, lƣợng enzyme khá ít nên sau 4 giờ phản ứng vẫn còn nhiều pectin chƣa đƣợc thủy phân. Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ này lên tới 50 và 60 U/g, quá trình thủy phân xảy ra sâu hơn, phổ sản phẩm xuất hiện lƣợng đƣờng đơn (G1) khá nhiều (hình 3.21B). Ở tỷ lệ 40 U/g phổ sản phẩm chứa chủ yếu là đƣờng đôi, đƣờng ba và hàm lƣợng POS lớn nhất (hình 3.21A).
Tỷ lệ enzyme/cơ chất rất khác nhau đối với nguồn enzyme và đặc biệt với nguồn cơ chất khác nhau. Cơ chất là pectin củ cải đƣờng, Martini M. và cộng sự dùng polygalacturonase tỷ lệ 10 U/g và cellulase 0,725 U/g thu đƣợc 26,7 kg POS/100kg pectin
G1
G2
G3
M 1 2 3 4 5
[79]; với cơ chất pectin táo Nikolic M.V. và cộng sự dùng hỗn hợp enzyme polygalacturonase tỷ lệ 162 U/l và pectinase 27 U/l [91]; còn đối với pectin từ vỏ chanh Gomez B. và cộng sự báo cáo sử dụng Viscozyme L với hoạt độ polygalacturonase 5 U/g và thời gian thủy phân 24 giờ. Khi đó lƣợng POS thu đƣợc đạt 3,65 g/l [43].
Do vậy, với nguồn cơ chất pectin từ vỏ chanh leo và enzyme endopolygalacturonase lựa chọn tỷ lệ enzyme/cơ chất 40 U/g pectin cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân giới hạn pectin chanh leo nồng độ 3% (w/v) đƣợc thực hiện ở các giá trị nhiệt độ 40C, 50C và 60C. Sau khi dừng phản ứng thủy phân tiến hành xác định hàm lƣợng và thành phần của POS, kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.22.
Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; giếng 1-3 tƣơng ứng với nhiệt độ 40, 50, 60oC
Kết quả thí nghiệm cho thấy, ở nhiệt độ 40C tốc độ phản ứng thủy phân chậm (lƣợng G2 và G3 ít). Khi tăng nhiệt độ phản ứng lên 60C, lƣợng đƣờng đơn tạo ra quá nhiều. Trong khi phản ứng tiến hành ở 50C, dịch thủy phân đã xuất hiện lƣợng G2 và G3 mong muốn (hình 3.22B) và tổng lƣợng POS tạo ra cao nhất (hình 3.22A).
Nhƣ vậy, dù cả 3 mức nhiệt độ này đều nằm trong ngƣỡng nhiệt độ hoạt động của enzyme nhƣng hàm lƣợng sản phẩm POS thu đƣợc có nhiều sự khác biệt. So sánh với phần nghiên cứu điều kiện nhiệt độ thủy phân pectin nồng độ 1% (w/v) (hình PL3.1, phụ lục 3), nhận thấy có sự thay đổi về nhiệt độ thủy phân của hai nồng độ 1% và 3% (w/v). Với nồng độ pectin 1% (w/v), phản ứng thủy phân chỉ cần điều kiện là 40C trong khi đó với 3%
G1 G2 G3 B M 1 2 3 A
(w/v), ta phải nâng nhiệt độ thủy phân lên đến 50C. Nguyên nhân của sự sai khác này có thể đƣợc giải thích do ở nồng độ 3% (w/v), dịch thủy phân có độ nhớt cao hơn, nhiệt độ cao hơn sẽ giúp cho các polygalacturonic acid kéo giãn mạch, làm cho enzyme dễ dàng tham gia phản ứng tạo POS và 50oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme.
Nhiệt độ thủy phân 50oC cũng đƣợc sử dụng bởi một số báo cáo [15, 60, 67, 75, 91], do vậy lựa chọn nhiệt độ này cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.4. Ảnh hưởng của pH
Mỗi enzyme đều có khoảng pH tối ƣu khác nhau mà tại đó hoạt tính enzyme đạt cao nhất. Trong quá trình thủy phân pectin, enzyme chịu tác động của nhiệt độ, thời gian, pH dịch thủy phân thay đổi (do sản phẩm tạo thành có tính acid) và khuấy trộn cơ học… Vì vậy, nghiên cứu xác định pH tối ƣu cho quá trình thủy phân giới hạn pectin chanh leo tạo POS là công việc hết sức cần thiết.
Để xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân pectin chanh leo, tiến hành thủy phân pectin với các thông số: pectin nồng độ 3% (w/v), tỷ lệ enzyme/cơ chất 40 U/g, nhiệt độ phản ứng 50C, tốc độ khuấy 250 vòng/phút. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.23.
Hình 3.23Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo
M: galacturonic acid, digalacturonic acid, trigalacturonic acid chuẩn; giếng 1 - 3 với pH 3, pH 4, pH 5
Với hình 3.23B thấy rằng thí nghiệm tiến hành ở mức pH 4 tƣơng ứng cho kết quả tốt nhất. Sản phẩm thủy phân đã xuất hiện các vệt G2 và G3 rất rõ. Đồng thời, lƣợng monogalacturonic acid tạo ra cũng ít hơn thí nghiệm ở pH 5 thể hiện ở vệt monogalacturonic (G1) mờ hơn. B G2 G3 G1 M 1 2 3 A B
Kết quả xác định hàm lƣợng oliosaccharide ở hình 3.23A cho kết quả tƣơng tự. Với các mức pH 4 và pH 5, lƣợng POS tạo thành tƣơng ứng là 16,43 mg/ml và 13,05 mg/ml. Trong khi đó với mức pH 3, lƣợng POS tạo thành chỉ là 10,07 mg/ml. Nhƣ vậy có thể thấy rõ, pH có ảnh hƣởng tới hiệu suất quá trình thủy phân pectin tạo POS và mức pH đƣợc lựa chọn là pH 4.
Kết quả nghiên cứu trên nguồn cơ chất pectin từ vỏ chanh leo và enzyme có hoạt tính endopolygalacturonase cũng nằm trong khoảng pH 4 – 5 của pH tối ƣu của enzyme nhƣ báo cáo của các tác giả khác. Bako K.B. và cộng sự, Kiss K. và cộng sự thủy phân giới hạn pectin bằng polygalacturonase ở pH 4.1 bằng đệm citrate [15, 60]. Gomez B. và cộng sự thủy phân pectin từ vỏ chanh tạo POS bằng Viscozyme L, pectinase 62 L và Pectinex Ultra SP-L ở pH 5 [43]. Nikolic M.V. và cộng sự thủy phân polygalacturonic acid bằng polygalacturonase và pectinase ở pH 4,5 thu đƣợc hàm lƣợng POS cao nhất [91]. Li S. và cộng sự báo cáo họ sử dụng endopolygalacturonase từ A. niger để thủy phân pectin từ quả sơn trà ở pH 3,5 trong 2 giờ thu đƣợc POS chủ yếu DP <11 [67].
3.2.2.5. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy
Do cơ chất pectin khi hòa tan trong đệm citrate pH 4,0 có độ nhớt cao. Điều này có ảnh hƣởng đến quá trình tiếp xúc của enzyme với cơ chất. Để ứng dụng quy trình sản xuất POS vào quy mô lớn cần nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện khuấy đến hiệu suất quá trình thủy phân.
Tiến hành thủy phân pectin với các thông số nhƣ sau: nồng độ pectin 3% (w/v) , tỷ lệ enzyme/cơ chất 40 U/g pectin, thủy phân trong đệm citrat pH 4,0, nhiệt độ 50C. Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện trong 4 giờ ở các tốc độ khuấy 200 – 350 vòng/phút. Kết