2.4.3.1. Chu kỳ ngưỡng (Threshold cycle -Ct)
Khái niệm chu kỳ ngưỡng (Ct) là khái niệm trung tâm của kỹ thuật real-time PCR. Nguyên tắc định lượng của kỹ thuật này dựa vào một đường cong chuẩn (standard curve) được xây dựng từ các giá trị chu kỳ ngưỡng của các mẫu đã có nồng độ nucleic acid biết trước. Chu kỳ ngưỡng của một mẫu được định nghĩa là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt trên tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng PCR và được các thiết bị cảm biến ghi nhận. Chu kỳ ngưỡng rơi vào pha lũy thừa ( exponential phase) của phản ứng PCR. Vì vậy, việc định lượng trong phản ứng là chính xác vì không chịu bất kỳ ảnh hưởng nào từ pha bão hòa (plateau phase) của phản ứng PCR. Các mẫu có nồng độ nucleic acid ban đầu lớn thì có Ct nhò và ngược lại các mẫu có nồng độ nucleic acid nhò thì có Ct lớn. Tín hiệu huỳnh quang nền được tạo ra trong phản ứng real-time PCR là do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn trong thành phần phản ứng PCR.
Chất phát huỳnh quang này khác với chất phát huỳnh quang được sử dụng để định lượng. Trong phản ứng real-time PCR sử dụng Taqman probe thì chính quencher của Taqman probe sẽ đóng vai trò tạo tính hiệu nền cho phản ứng.
2.4.3.2. Đường chuẩn (Standard curve)
Việc định lượng trong phản ứng real-time PCR được thực hiện bằng cách so sánh hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu có nồng độ đã biết được nhân bản đồng thời. Các thiết bị thực hiện phản ứng real- time PCR sẽ tự động xây dựng một đường cong chuẩn dựa trên chu kỳ ngưỡng (Ct) của các mẫu có nồng độ nucleic acid biết trước (các mẫu chuẩn-standard samples). Sau đó, nồng độ nucleic acid cuả các mẫu xét nghiệm sẽ được tính toán dựa trên đường cong chuẩn này. Có nhiều cách để thiết kế một đường cong chuẩn cho một phản ứng real time PCR. Người ta cũng có thể tinh sạch sản phẩm PCR (được nhân bản với cặp Primer sử dụng cho phản ứng real-time PCR) từ gel agarose, đo nồng độ của sản phẩm bằng phương pháp đo mật độ quang, từ đó tính ra số bản sao của sản phẩm để xây dựng đường cong chuẩn. Đối với việc định lượng HCV, người ta cũng sử dụng phương pháp bDNA hoặc bộ kít HCV Monitor (Roche Diagnostics) để xác định nồng độ vi rút của các mẫu dùng xây dựng đường cong chuẩn. Một phương pháp khác phức tạp hơn là sử dụng một plasmid biểu hiện có chứa trình tự cần nhân bản để tổng hợp RNA. Các RNA được đánh dấu phóng xạ và số lượng phân tử RNA có trong mẫu được xác định bằng phương pháp isotopic tracing. Mẫu có hàm lượng RNA biết trước dùng để xây dựng đường cong chuẩn cho phản ứng real-time PCR.